视神经脊髓炎患者血清胶质纤维酸性蛋白的表达及临床意义

解丽丽 孙一鸣 张美艳 刁剑霞 王苏平 吕洪涛

[摘要] 目的 通过检测视神经脊髓炎（neuromyelitis optic，NMO）患者与健康人的血清神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）水平，研究GFAP水平与NMO之间的关系。 方法 收集2013年6月～2015年4月的NMO患者27例和27例健康人的血清，采用酶联免疫吸附剂法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测样品吸光度，计算出GFAP的浓度。 结果 NMO患者组的血清GFAP浓度高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论 NMO患者组的血清GFAP浓度高于对照组，血清GFAP浓度与NMO之间有关联。

[关键词] 视神经脊髓炎；胶质纤维酸性蛋白；酶联免疫吸附剂法；血清

[中图分类号] R744.52 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）30-0001-03

Expression and clinical significance of glial fibrillary acidic protein in the seruum of neuromyelitis optic patients

XIE Lili1 SUN Yiming1 ZHANG Meiyan1 DIAO Jianxia1 WANG Suping1 LV Hongtao2

1.Department of Neurology， Dalian Central Hospital， Dalian 116033， China； 2.Department of Neurosurgery， the First Hospital Affiliated to Dalian Medical University， Dalian 116011， China

[Abstract] Objective To study the relationship between GFAP level and NMO by testing GFAP level in serum of neuromyelitis optic patients and health people. Methods Collected the serum of NMO patients （n=27） and health people （n=27） from June 2013 to April 2015. Then detected the absorbance values of the samples by using ELISA experiment， computed the concentration of GFAP. Results The concentration of GFAP in the serum were significantly higher in NMO patients than that in health people， the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The concentration of GFAP in the serum are significantly higher in NMO patients than that in health people. The concentration of GFAP is in association with NMO.

[Key words] Neuromyelitis optic； Glial fibrillary acidic protein； ELISA； Serum

视神经脊髓炎（neuromyelitis optic，NMO）是一种主要累及视神经和脊髓中枢神经系统（central nervous system，CNS）的炎性脱髓鞘性疾病，亚洲是发病率最高的地方，患者以20～40岁中青年为主，女性略多于男性，临床上主要以视神经和脊髓同时或相继受累为主要特征，大多表现为缓解和复发的病程，发病机制和病因尚未完全清楚[1]。诊断需符合2007年Wingerchuk的NMO诊断标准，治疗药物多以免疫抑制剂为主[1]。星形胶质细胞在NMO免疫過程中具有中枢性作用，而神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是一种星形胶质细胞的生物标志物[2，3]。国外研究显示[3]在NMO患者的脑脊液中GFAP浓度明显升高，本研究主要通过检测视神经脊髓炎（neuromyelitis optic，NMO）患者（2013年6月～2015年4月）与健康人的血清神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）水平，研究GFAP水平与NMO之间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择我院神经内科2013年6月～2015年4月收治的NMO患者27例（男14例，女13例）并收集患者的血清，其中年龄最小25岁，最大55岁，平均年龄（37.5±4.5）岁。另选我院体检中心的27例健康人作为对照组。其中男13例，女14例。年龄最小22岁，最大56岁，平均年龄（36.5±12.6）岁。NMO患者组与对照组患者在性别构成比、年龄等方面比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 NMO患者诊断标准

（1）年龄15～60岁；（2）均符合2007年Wingerchuk制定的NMO诊断标准[4，5]。必要条件：视神经炎与急性脊髓炎。支持条件：脊髓MRI表现异常，病灶累及超过3个椎体节段；头颅MRI不符合多发性硬化诊断标准；血清NMO-IgG阳性。如果必要条件全部符合，再加上支持条件中的2条，即可确诊为NMO。

1.3 排除标准

（1）曾患有脑卒中；（2）曾患有脑星形细胞瘤；（3）近期感染、组织损伤；（4）其他自身免疫性疾病。

1.4 方法

1.4.1 样本采集 空腹采集肘部静脉血5 mL，存放于EDTA促凝试管中，之后置4℃冰箱2 h，等待血液凝固上下分层后，放到高速离心机中，3000 rpm，离心5 min，吸取上层血清，使用移液器将血清移到2 mL试管中，-20℃冰箱内储存备用。

1.4.2 主要实验试剂和仪器 神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）酶联免疫试剂盒（CUSABIO BIOTECH公司）。常温离心机（Eppendorf公司，美国），微量移液器（Eppendorf公司，美国），METERTECM ∑960酶标仪（上海医疗器械七厂），BD-132冰箱（海尔公司，青岛），37℃细胞培养箱（Shel Lab，美国）。

1.4.3 ELISA检测步骤 从冰箱取出GFAP抗体ELISA试剂盒，置室温30 min。准备标准品：在标准品中加入150 μL的稀释液，调整到20 ng/L浓度，然后倍比稀释，分别稀释为5个浓度：1200 ng/L、600 ng/L、300 ng/L、150 ng/L、75 ng/L。将标准品和血清样品各稀释5倍，每孔加40 μL的稀释液，然后加入10 μL样品，均匀振荡。用封板膜密封后，37℃孵育30 min。揭开封板膜，去掉液体，甩干，每孔加入洗涤液，放置30 s后弃掉，反复洗涤5次，干燥。每孔（空白孔除外）加入酶标试剂50 μL。再次进行之前步骤。每孔依次加入显色剂A、B各50 μL，摇匀后避光显色20 min。每孔加入终止液50 μL，终止反应。设置空白孔为0.450 nm波长依序测量各孔吸光度（OD值）。

1.4.4 结果分析 制作标准曲线y=1352.3x-426.34，根据各个样品的OD值代入标准曲线方程，测得各个样品的浓度。

1.5 统计学方法

实验数据通过SPSS19.0统计学软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

NMO患者血清GFAP的水平为（655.5±85.8）ng/L，正常人血清中GFAP水平为（249.8±26.3）ng/L；NMO患者组血清GFAP浓度高于健康对照组，差异具有统计学意义（t=2.03，P<0.05），见表1、图1。

3讨论

视神经脊髓炎是主要累及视神经和脊髓的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，且多见于亚洲人。在NMO患者中，炎性机制起到了更为重要的作用，以IgG为主的免疫球蛋白沉淀与堆积在血管周围，出现嗜酸性细胞的浸润与补体激活则充分提示为Th2应答。NMO患者中，相对于髓鞘脱失，星形胶质细胞的损伤则更加严重。最近的研究发现，中枢神经系统水通道蛋白aquaporin-4（AQP4）抗体（NMO-IgG）是NMO特异性的免疫学标记物[6，7]。

星形胶质细胞在中枢神经系统分布广泛，对神经元起到支持和营养的作用，在损伤应答、宿主防御和组织修复中发挥重要的作用。星形胶质细胞的活化情况可以由GFAP的表達来反映。GFAP位于细胞核周围和细胞质中，其相对分子量为5万，仅仅在星形胶质细胞中表达，而且表达丰富，是星形胶质细胞的重要构成成分，可特异性的标示星形胶质细胞，GFAP的表达量可以反映脑损伤后星形胶质细胞的反应情况。中枢神经系统损伤后，胶质细胞活化增生，胞体肥大、突起增多增长，GFAP快速合成且水平增加，其体液水平是评估星形胶质细胞增多症和星形胶质细胞激活的重要手段，可以间接反映脑损伤的程度。

GFAP的相关研究表明，在NMO中，随着星形胶质细胞的破坏，GFAP被释放入脑脊液导致脑脊液中GFAP水平大幅增加[2，8，9]。Akiyuki U等[10]研究表明脑脊液中的GFAP可能是NMO的诊断标记物。以上研究结果与本实验结果相一致，NMO患者的血清中GFAP浓度明显高于对照组，但这种升高是否与视神经病变或脊髓病变相关，仍需要深入进一步的研究。邵林华等[11]研究发现，脑损伤后血清GFAP升高，而且其升高水平与急性期脑损伤的程度可能存在相关性。Dvorak F等[12]研究发现，GFAP表达量的多少可以作为研究脑损伤的胶质细胞反应的标记物。NMO是一种比多发性硬化更严重的疾病，NMO致残与复发的频率和早期充分的免疫抑制治疗策略密切相关[13-15]。

综上所述，NMO患者中星形胶质细胞的活性增加，引起星形胶质细胞坏死，大大增加了血脑屏障的通透性，从而显著提高了GFAP在血清中的含量。NMO患者的血清GFAP浓度高于对照组，提示GFAP血清浓度在NMO的临床诊断上具有一定的应用价值，GFAP能够早期释放且稳定，能够迅速定量测定而且价格便宜，有助于临床医生诊断和评估患者病情，为NMO的预防和治疗提供了理论依据，可改善患者的预后。

[参考文献]

[1] Wingerehuk DM. Diagnosis and treatment of neuromyelitis optica[J]. The Neurologist，2007，13：2-11.

[2] Takano R，Misu T，Takahashi T，et al. Astrocytic damage is far more severe than demyelination in NMO：A clinical CSF biomarker study[J]. Neurology，2010，75（3）：208-216.

[3] Fujihara K. Neuromyelitis optica and astrocytic damage in its pathogenesis[J]. J Neurol Sci，2011，306（1-2）：183-187.

[4] Wingerchuk DM，Lennon VA，Lucchinetti CF，et al. The spectrum of neuromyelitis optica[J]. Lancet Neurol，2007， 6：805-815.

[5] Wingerchuk DM，Lennon VA，Pittock SJ，et al. Revised diagnostic criteria for neuromyelitis optica[J]. Neurology，2006，66：1485-1489.

[6] Papadopoulos MC，Verkman AS. Aquaporin 4 and neuromyelitis optica[J]. Lancet Neurol，2012，11：535-544.

[7] Saadoun S，Waters P，Leite MI，et al. Neuromyelitis optica IgG causes placental inflammation and fetal death[J]. J Immunol，2013，191（6）：2999-3005.

[8] Misu T，Takano R，Fujihara K，et al. Marked increase in cerebrospinal fluid glial fibrillar acidic protein in neuromyelitis optica：An astrocytic damage marker[J]. Neurol Neurosurg Psychiatry，2009，80（5）：575-577.

[9] Petzold A，Marignier R，Verbeek MM，et al. Glial but not axonal protein biomarkers as a new supportive diagnostic criteria for Devic neuromyelitis optica？ Preliminary results on 188 patients with different neurological diseases[J]. Neurol Neurosurg Psychiatry，2011，82（4）：467-469.

[10] Akiyuki U，Masahiro M，Setsu S，et al. Cerebrospinal fluid interleukin-6 and glial fibrillary acidic protein levels are increased during initial neuromyelitis optica attacks[J]. J Clinica Chimica Acta，2013，421：181-183.

[11] 邵林華，陈亦，华郑龙，等. 颅脑损伤患者血清GFAP含量变化及其临床意义[J]. 全科医学临床与教育，2011， 9（3）：255-257.

[12] Dvorak F，Haberer I，Sitzer M，et al. Characterisation of the diagnostic window of serum glial fibrillary acidic protein for the differentiation of intracerebral haemorrhage and ischaemic stroke[J]. Cerebrovasc Dis，2009，27（1）：37-41.

[13] Mealy MA，Wingerchuk DM，Palace J，et al. Comparison of relapse and treatment failure rates among patients with neuromyelitis optica：Multicenter study of treatment efficacy[J]. JAMA Neurol，2014，71：324-330.

[14] Ayzenberg I，Kleiter I，Schr？觟der A，et al. Interleukin 6 receptor blockade in patients with neuromyelitis optica nonresponsive to anti-CD20 therapy[J]. JAMA Neurol，2013，70（3）：394-397.

[15] Bichuetti DB，De Oliveira EM，De Souza NA，et al. Patients with neuromyelitis optica have a more severe disease than patients with relapsingremitting multiple sclerosis，including higher risk of dying of a demyelinating disease[J]. Arq. Neuropsiquiatr，2013，71：275-279.

（收稿日期：2015-06-02）