苗药乌纠不同提取部位的止血活性研究

李春荣　孟铁宏　王恒

【摘 要】 目的：探讨乌纠的止血活性部位，为其止血活性成分的筛选提供线索和依据。方法：用60%乙醇对乌纠原药材活性成分进行提取，回收乙醇，然后依次用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯对醇浸膏进行萃取，分别制得相应的部分和水部分。然后通过测定小鼠凝血时间、出血时间和血小板计数（PLC）等方法考察其活各部分的止血效果。结果：石油醚部分、正丁醇部分、乙酸乙酯部分和水部分均有止血作用，乌纠中石油醚提取物的止血效果最佳。

【关键词】 乌纠；出血；活性部位

【中图分类号】R29 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）11-0001-02

苗药乌纠系铁角蕨科铁角蕨属植物变异铁角蕨（Asplenium varians Wall.ex Hook.et Grev.）的全草，又名九倒生、铁郎鸡、地柏枝，主要分布于云南、贵州、四川至山西等地，是贵州苗族居住地区传统的民间药物，其性凉，味微苦，具有活血消肿、止血生肌的作用[1]。目前，铁角蕨属植物的化学成分和药理研究已有相关报道[2]，但关于苗药乌纠化学成分及止血活性部位的研究还未见报道。本文在对乌纠进行分段提取的基础上，考察乌纠的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物对小鼠止血活性的实验，为进一步研究其止血活性成分及止血机制提供指导。

1 材料与方法

1.1 药材 乌纠：产地贵州黔南、黔东南苗族地区，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为铁角蕨科铁角蕨属植物变异铁角蕨（Asplenium varians Wall.ex Hook.etGrev.）的全草；云南白药（瓶装）（批号：ZL13022，云南白药集团股份有限公司）。

1.2 动物 昆明种小鼠，清洁级，体重（20±2）g，雌雄各半，由贵阳医学院试验动物中心提供，合格证号：SCXK（黔）2002-0001。

1.3 试剂 石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇均为分析纯。

1.4 实验方法

1.4.1 供试液的制备 取干燥乌纠，粉碎，过20目筛，称取1000g，于10L圆底烧瓶，用 60%乙醇，80℃下回流提取2.5h，抽滤，平行提取3次，合并抽滤液，滤液经减压回收乙醇，至无醇味，得到乌纠粗提取物。然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收有机溶剂，真空干燥（60℃），制成干浸膏[3]，分别得到石油醚提取物部位、正丁醇提取物部位、乙酸乙酯提取物部位和水提取物部位浸膏，并称定各提取物，临用前，用0.1% -CMC配成适宜浓度的溶液。

1.4.2 出血时间（BT）的测定（断尾法） 取小鼠60只，随机分为6组，即空白对照组、云南白药组（即阳性对照组，0.5g/kg）和石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组及水提物组4个给药组（提取物），试验小鼠每个给药组10只，雌雄各半。称取一定量的提取物用0.1% -CMC配成3g/kg药剂，分别灌胃给药1次/d，连续7d。末次给药后30min，小鼠夹固定，将小鼠尾尖0.5cm处横向切断，当血液自动流出时开始计时，每隔30s用滤纸吸去血滴1次，到血液不再流出为止（滤纸吸时无血）[4-5]，以人工创面形成到出血停止所用时间作为出血时间。

1.4.3 凝血时间（CT）测定 取小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，分组给药均与1.4.2方法相同，末次给药后30min，用眼科弯镊迅速摘去一侧眼球即有血液流出，用棉球擦去第一滴血，再于载玻片两端各滴1滴血，血滴直径约为5mm，立即记时，每隔30s用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动1次，并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝止所需时间即为凝血时间。

1.4.4 小鼠血小板计数（PLC） 取小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，分组给药均与1.4.2方法相同，末次给药后30min，用毛细取血管在小鼠眼内眦球采血10μL用血小板稀释液稀释100倍，普通光学显微镜下计数（PLC）。

1.5 统计学方法 数据采用SPSS 20.0软件进行分析处理，数据以（x[TX-*3]±s）表示，对数据进行双样本t检验和方差分析，P<0.05表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 对小鼠出血（BT）时间的影响 与空白生理盐水组比较，乌纠的石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部位、水提取部位和云南白药组均能显著缩短小鼠出血时间，且具有统计学意义（P<0.05），其中水提取部位的效果最佳，出血时间为（93.75±37.39）S。

2.2 对小鼠凝血时间（CT）的影响 和空白生理盐水组对比，石油醚提取部位、正丁醇提取能明显缩短小鼠凝血时间，并且有统计学意义（P<0.05）。而乙酸乙酯提取物部分对小鼠凝血时间效果不明显。小鼠凝血时间见表2。

2.3 对小鼠血小板计数（PLC）的影响 由表3可见，与空白生理盐水组比较，乌纠的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物均能显著加快血小板的凝聚作用，其促凝作用最大的为乙酸乙酯部位，其中水提取物部分的效果最佳。

3 讨论

小鼠断尾出血时间和玻片凝血时间由于方法直观，操作简便，广泛用于止血中药活性的筛选。出血时间是指皮肤受特殊刺破后出血并自动停止所需的时间，常用于评价皮肤毛细管的止血能力，也是观察受试药物对凝血机制有无影响的第一步[8]。实验结果表明，乌纠提取物的石油醚部位、乙酸乙酯部位和水提取部位均能显著缩短小鼠出血时间；凝血时间是指血液离开机体后到完全凝固所需要的时间，它的长短反映血液中参与凝血的各种凝血因子的含量以及它们的功能，其中血小板的数量和功能以及毛细血管功能是决定性因素，在凝血时间的实验中，只有乙酸乙酯部位对小鼠凝血效果不明显，石油醚、正丁醇和水提取物均对小鼠凝血效果明显，且能有效降低小鼠的血小板数量。石油醚部位的出血时间、凝血时间与云南白药的实验数据接近，说明乌纠提取物中石油醚部位的止血效果最好，其凝血活性成分、凝血机制有待进一步研究。

根据出血时间（BT）和凝血时间（CT）实验结果发现，乌纠的石油醚部位和水提取部位具有良好的止血和凝血活性，证明了苗药乌纠是一味止血良药，也为进一步探究苗药乌纠的止血活性成分分析及止血机制奠定了基础。

参考文献

[1]王玲，何兆荣.药用蕨类植物化学成分研究进展[J].中国野生植物资源，2006，3（10）：25-26.

[2]于永明.披针观音座莲和半边铁角蕨的化学成分及生物活性研究[D].中国医学科学院博士学位论文，2009：21-38.

[3]王树松，王晓岚.柿叶止血成分的实验研究[J].河北中医，2005，27（1）：6-68.

[4]石磊，李昌勤，廉婷婷，等.见血飞对小鼠出血时间和凝血时间的影响[J].中国药房，2010，21（47）：2243-2244.

[5]吴久健，孟岳良，邹丽华，等.白及不同提取部位对小鼠止血活性实验[J].药学实践杂志，2011，29（3）：206-208.

[6]刘晨，柳佳，郑传柱，等.侧柏炭止血作用活性部位筛选[J].中国中药杂志，2014，39（16）：2152-2157.

[7]石朗，杜冰，张婷婷，等.鸡冠花不同提取部位止血作用研究[J].医药导报，2013，32（9）：1122-1124.

[8]梅兴国，万国晖，周国强，等.火棘提取物对血液凝固的影响[J].中药材，2001，24（12）：874-875.

（收稿日期：2015.04.06）