压热—酶法制备紫薯抗性淀粉的工艺优化

李宝瑜　郑宝东　曾绍校　郑亚凤

摘 要 为了提高紫薯抗性淀粉的含量，以紫薯淀粉为原料，采用压热-酶法制备紫薯抗性淀粉，通过单因素试验，研究了淀粉乳浓度、普鲁兰酶用量、酶解时间、压热时间对紫薯抗性淀粉含量的影响。利用正交方法优化了压热-酶法制备紫薯抗性淀粉的最佳工艺条件。结果表明：普鲁兰酶用量、压热时间对紫薯抗性淀粉的含量影响显著（p<0.05）；制备紫薯抗性淀粉最佳工艺为：淀粉乳浓度30%、酶用量1 U/g淀粉、酶解时间12 h、压热时间45 min；在此条件下，所得紫薯抗性淀粉含量为17.16%，较单一压热法提高了67.74%。说明经过普鲁兰酶的脱支协同处理，能进一步提高紫薯抗性淀粉的含量，这对紫薯抗性淀粉的制备有一定应用价值。

关键词 紫薯；抗性淀粉；压热酶法

中图分类号 TS23 文献标识码 A

Abstract Using purple potato starch as the raw material，the resistant starch was prepared through the autoclave combined with enzyme hydrolysis treatment to improve the the yield of resistant starch prepared. To optimize the processing conditions，the effects of starch concentration，pullulanase dosage，reaction time，and autoclaving time value on the production rate of resistant starch were studied. The result showed that the dosage of pullulanase and autoclaving time had significant effects on the resistant starch production（p<0.05）. The orthogonal method was applied for the processing optimization and the highest production of purple potato resistant starch reached to 17.16% with the followed conditions：starch concentration of 30%，the dosage of 1 U/g，reaction time of 12 h and reaction time of 45 min. Compared with the autoclave method，the yield of resistant starch prepared from the method combined with enzyme increased by 67.74%. This suggests that the resistant starch prepared through the autoclave combined with enzyme hydrolysis treatmen would improve the the yield. It has certain application value on the purple potato resistant starch preparation .

Key words Purple sweet；Resistant starch；Autoclave combined with enzyme treatment

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.024

抗性淀粉（RS）是指在健康人体小肠内不能被消化吸收，但能在大肠中发酵或部分发酵的淀粉及其降解产物[1]。抗性淀粉可分为4类：RS1（物理包埋抗消化性淀粉），RS2（抗性淀粉颗粒），RS3（回生淀粉），RS4（化学改性淀粉）[2]。有研究结果表明，RS具有一系列独特的生理功能，如促进免疫功能、对糖尿病的预防功能及调节肠道菌群等[3]。早期许多关于RS的研究主要集中于它在大肠中所产生短链脂肪酸（SCFA）上，近年来国内外的研究焦点是RS作为益生元的潜力[4]。目前已知的益生元主要有多糖、低聚果糖，以及其它抗性低聚糖，如菊糖类型的果聚糖。抗性淀粉作为一种膳食碳水化合物，能毫无变化地通过小肠进入大肠，并在大肠中发酵产生短链脂肪酸和其他产物。大量研究证实，抗性淀粉具有促进双歧杆菌、乳杆菌明显增殖的作用[5-6]，也有可能作为益生菌生长底物的来源，这可能与抗性淀粉能完全逃避小肠消化密切相关。目前RS的制备方法主要有压热处理法、脱支降解法以及复合法等，一般采用压热法制备抗性淀粉时，常与酶法协同进行。普鲁兰酶（Pullulanase）是异淀粉酶的一种，能切开支链淀粉分支点的a-1，6糖苷键，从而使淀粉的水解产物中含有更多游离的直链淀粉分子。已有研究发现，经过普鲁兰酶脱支处理后更有利于抗性淀粉的生产[7]。

薯类淀粉中紫薯淀粉糊化温度高，热稳定性和凝胶性好[8]，是制备粉丝、粉皮等的良好原料。紫薯淀粉的直链淀粉含量高于甘薯和木薯[8-9]，而目前的研究表明，直链淀粉含量越高则越易老化返生并生成抗性淀粉[10]。这为紫薯抗性淀粉的制备提供了理论依据。本研究以紫薯淀粉为原料，采用压热-酶法制备紫薯抗性淀粉，在单因素试验的基础上，利用正交法优化，确定制备紫薯抗性淀粉的最佳工艺条件，为今后紫薯抗性淀粉的制备及应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 紫薯，产自福建长乐。

1.1.2 试剂 抗性淀粉酶试剂盒[包括：淀粉葡糖苷酶AMG（3 300 U/mL）、胰α-淀粉酶、GOPOD试剂缓冲液、GOPOD试剂酶和D-葡萄糖标准溶液]（爱尔兰Megazyme 公司）；普鲁兰酶（1 000 u/g）[杰能科（中国）生物工程有限公司]；二水氯化钙、叠氮化钠、氢氧化钠、冰醋酸、氢氧化钾均为分析纯。

1.1.3 仪器设备 MJ-60BM01A美的搅拌机（广东美的生活电器制造有限公司）；SYQ-DSX-280B型高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；SHA-B型水浴恒温振荡器（常州国华电器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；HQ-60型漩涡分离器（北方同正生物技术发展有限公司）；PB-10 pH计[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；PL602-L分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；L-530型台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；UV-2000型紫外分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 紫薯淀粉的提取 将新鲜的紫薯洗净去皮后，切成小块，放入搅拌机中，以1 ∶ 3料液比加水搅拌，薯浆经100目绢布过滤，所得薯泥再加水搅拌重复过滤3遍，将淀粉全部洗到滤液中[11]；静置6 h后弃上清液，用蒸馏水洗涤下层沉淀；继续静置6 h后，弃上清液，将下层沉淀置于45 ℃烤箱中干燥12 h，粉碎，过100目筛，即得紫薯淀粉样品。

1.2.2 紫薯抗性淀粉的制备工艺 （1）压热法制备：称取10 g紫薯淀粉，加入一定量的蒸馏水，配制成浓度为30%的淀粉乳，pH为6；预糊化后，放入高压灭菌锅中，于110 ℃下处理45 min；取出冷却至室温，并将样品放入4 ℃冰箱中，冷藏24 h；取出回生的淀粉，于60 ℃下烘干16 h；粉碎，过100目筛。

（2）压热-酶法制备：称取10 g紫薯淀粉，加入蒸馏水，配制成一定浓度的淀粉乳，调节pH为4.8，加入一定量的普鲁兰酶，置于60 ℃恒温水浴锅中酶解一定时间后，以95 ℃灭酶15 min，之后调pH为6；继而放入高压灭菌锅中，于110 ℃下处理一定时间；取出冷却至室温，并将样品放入4 ℃冰箱中，冷藏24 h，取出回生的淀粉，于60 ℃下烘干16 h；粉碎，过100目筛。

1.2.3 单因素试验方案 选取不同的紫薯淀粉乳浓度（15%、20%、25%、30%、35%、40%）、普鲁兰酶用量[0.5、1、2、4 、8 U/g淀粉（以干基淀粉计算）]、酶解时间（1、2、6、12、18、24 h）、压热时间（10、20、30、40、50 min）4个因素对样品进行糊化处理，每组做3个平行实验，考察各个因素对紫薯抗性淀粉含量的影响。

1.2.4 抗性淀粉含量测定 采用Megazyme公司的抗性淀粉酶测定试剂盒，根据AOAC2002.02标准方法测定抗性淀粉含量。

往样品中加入α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG），于37 ℃振荡水浴孵育16 h，在这期间，通过2种酶的联合作用，非抗性淀粉被溶解，水解成D-葡萄糖，孵育结束后，加入等体积的乙醇或工业甲基化酒精（IMS，变性乙醇）终止反应；离心上述溶液，收集上清，底部残留絮状团即为样品中的RS，用含水的IMS或乙醇（50%V/V）洗涤絮状团，洗涤后离心，再重复洗涤离心1次，收集离心后获得的上清，与之前收集的上清混合；小心倒出试管残留的液体，将絮状团置于冰水浴中，加入2 mol/L KOH溶解，溶解的同时用磁力搅拌机剧烈搅拌；用醋酸盐缓冲液将这个溶液调至中性，用AMG将淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂（GOPOD）测定，这也是对样品中RS含量（%）的测定；非抗性淀粉（可溶性淀粉）的测定：将集中的上清液定容至100 mL，再用GOPOD测定D-葡萄糖。

2 结果与分析

2.1 工艺条件对紫薯抗性淀粉含量的影响

2.1.1 不同淀粉乳浓度对紫薯抗性淀粉含量的影响 由图1可知，当淀粉乳浓度为30%时，紫薯抗性淀粉含量达到最高，相对于其它浓度有显著差异。过高或过低的淀粉乳浓度都不利于抗性淀粉的形成[12]。淀粉乳浓度大于30%时，由于水分含量过低，淀粉乳黏度很大，不利于直链淀粉分子相互接近，故此时紫薯抗性淀粉含量较淀粉乳浓度为30%时低。而当水分含量较高时，也不利于抗性淀粉的形成，这是由于淀粉浓度太低，直链淀粉相互接近的概率减少，容易出现部分糊化现象[13]。

2.1.2 不同普鲁兰酶用量对紫薯抗性淀粉含量的影响 由图2可知，当普鲁兰酶用量为2 U/g淀粉时，紫薯抗性淀粉含量达到最高。普鲁兰酶的添加量过大或不足都不利于抗性淀粉的生成[14]。当酶用量过大时，会使淀粉分子脱支过度，形成短的直链淀粉链及低聚糖，无法形成抗性淀粉，故当普鲁兰酶用量超过2 U/g淀粉时，抗性淀粉含量呈下降趋势；而当酶用量不足时，淀粉分子脱支不完全，支链淀粉的支叉结构阻碍直链淀粉互相接近，也会降低抗性淀粉的含量[15]。因此，综合考虑普鲁兰酶脱支时间与普鲁兰酶添加量，选取2 U/g淀粉的普鲁兰酶添加量较为合适。

2.1.3 不同酶解时间对紫薯抗性淀粉含量的影响 由图3可知，当普鲁兰酶作用时间为12 h时，紫薯抗性淀粉含量达到最高，相对于其它普鲁兰酶作用时间有显著差异。有研究发现[16]，在淀粉的结晶过程和双螺旋结构形成过程中均需要合适的链长，脱支时间过短，普鲁兰酶作用不充分，脱支效果差；脱支时间过长，淀粉脱支过度，也会降低抗性淀粉含量，即太短或太长的分子链均不利于抗性淀粉的生成，这与本研究所得的结论一致。

2.1.4 不同压热时间对紫薯抗性淀粉含量的影响 由图4可知，当压热时间为40 min时，紫薯抗性淀粉含量达到最高，但相对于压热时间30 min理差异并不显著。在其它条件相同的情况下，压热时间过短时，直链淀粉分子不易接近或没有完全游离出来；压热时间过长时，淀粉分子会过度降解，形成短直链淀粉，这些短直链淀粉分子运动比较激烈，较难聚集形成晶体，不利于抗性淀粉的形成或形成的抗性淀粉抗酶解性不强，使其含量下降[17]。故当压热时间大于40 min时，紫薯抗性淀粉含量没有提高，反而呈下降趋势。

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验方案确定 在单因素试验基础上，采用L9（34）正交表进行4因素3水平的正交试验，获得制备紫薯抗性淀粉的工艺参数最优组合。试验因素水平设计见表1。

2.2.2 正交试验结果分析 根据表1确定试验方案，以抗性淀粉的含量为指标进行正交试验，试验数据如表2所示。由表2与表3可以看出，紫薯抗性淀粉最高含量可达到16.03%。影响压热-酶法制备紫薯抗性淀粉的反应条件中各因素主次为：B（酶用量）>D（压热时间）>C（酶解时间）>A（淀粉乳浓度），最佳因素组合为A2B1C2D3即淀粉乳浓度30%、酶用量1 U/g淀粉、酶解时间12 h、压热时间45 min。普鲁兰酶用量是其中最重要的影响因素。试验表明，控制普鲁兰酶的作用条件非常重要。

紫薯淀粉经过压热结合酶脱支后，抗性淀粉含量明显有所提高，此工艺条件下制备的抗性淀粉含量为16.03%。采用此工艺进行验证试验，所得的RS平均含量为17.16%，证明此参数组合确为最佳工艺。

2.3 压热法与压热-酶法对紫薯抗性淀粉含量影响

由表4可知，普通压热法制备所得紫薯抗性淀粉含量为10.23%。压热-酶法制备的紫薯抗性淀粉含量为17.16%，较压热法制备的提高了67.74%。说明经过普鲁兰酶脱支处理后更有利于抗性淀粉的生产。同时也表明RS的含量不仅由直链淀粉含量决定，也跟直链分子的分子量大小密切相关。

3 讨论与结论

抗性淀粉主要是通过直链淀粉双螺旋叠加（即直链淀粉重结晶）形成。淀粉糊在冷却放置的过程中，淀粉分子靠近分子链的末端区域并相互缠绕产生双螺旋结构，淀粉分子链进一步延伸并发生折叠卷曲，更有利于淀粉分子上的羟基形成螺旋之间的氢键，使淀粉糊充分老化[18]。压热法是目前制备抗性淀粉的一般方法，但得率较低。近年来有研究发现，通过采用多次压热-冷却处理，可以提高抗性淀粉的含量[19]。然而，随着压热-冷却循环次数的增加，生产周期延长，抗性淀粉的生产成本也随之增加。因此，在抗性淀粉的制备过程中，单一处理方法得到的抗性淀粉含量很低，在实际应用中可考虑多种技术联合应用。一般采用压热法制备抗性淀粉时，常与酶法协同进行。韦秋玉[20]采用脱支和不脱支2种方法来制备抗性淀粉，木薯淀粉未经脱支而直接糊化回生，得到的抗性淀粉含量为2.68%；而在同样淀粉浓度和糊化温度条件下，增加普鲁兰酶的脱支处理，发现抗性淀粉含量明显提高，达到5.63%。Hung等[7]发现经过脱支和老化处理，能显著提高香蕉淀粉的抗性淀粉含量，香蕉原淀粉样品中抗性淀粉含量为11.2%，而经脱支处理后淀粉中有较高含量的抗性淀粉（31.8%～48.1%）。由此可知，经普鲁兰酶脱支协同处理后更有利于抗性淀粉的生成。本研究利用压热法结合酶解处理制备紫薯抗性淀粉，单一压热处理制备所得紫薯抗性淀粉含量较低，仅为10.23%；而与普鲁兰酶协同进行制备，紫薯抗性淀粉含量提高了67.74%。本研究在减少循环次数的前提下，有效地提高了抗性淀粉的含量，缩短了生产周期，降低生产成本，为今后紫薯抗性淀粉生产提供一定的参考。

本研究通过单因素试验和正交分析法对紫薯抗性淀粉制备条件进行优化。经分析，对紫薯抗性淀粉含量影响显著的因素是酶用量，其次是压热时间。最佳工艺条件为淀粉乳浓度30%，酶用量1 U/g淀粉，酶解时间12 h，压热时间45 min，在此工艺条件下得到的抗性淀粉含量为17.16%。

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