不同地区板蓝根蛋白SDS—PAGE分析

杨欣 王秋红 王悦 郭慧 邢娜 匡海学

摘要：目的 采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术鉴别不同地区板蓝根，为板蓝根药材的鉴别和质量评价提供依据。方法 采用SDS-PAGE技术，建立黑龙江和河北地区板蓝根蛋白图谱。结果 黑龙江板蓝根蛋白约含13条亚基，主要为10.5 kD、23.0 kD、24.9 kD、44.1 kD 4种亚基，河北板蓝根蛋白约含12条亚基，主要为55.6 kD、45.9 kD、34.3 kD、18.9 kD、12.4 kD、10.5 kD 6种亚基。结论 SDS-PAGE技术可以用于鉴别不同地区的板蓝根。

关键词：板蓝根；鉴别；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.024

中圖分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）07-0086-03

Analysis on Isatidis Radix Protein in Different Areas by SDS-PAGE YANG Xin， WANG Qiu-hong， WANG Yue， GUO Hui， XING Na， KUANG Hai-xue （Key Laboratory of Basic and Appilication Research of Chinese Medicine， Ministry of Education；Heilongjiang Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacodynamic Material Bases；Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China）

Abstract：Objective To identify Isatidis Radix in different areas by SDS-PAGE；To provide the basis for the identification and quality evaluation of Isatidis Radix. Methods By using SDS-PAGE technology， the protein profiles of Isatidis Radix in Heilongjiang and Hebei regions were established. Results Isatidis Radix protein in Heilongjiang contained about 13 protein subunits， and the major subunits were 10.5 kD， 23.0 kD， 24.9 kD， and 44.1 kD. Isatidis Radix protein in Hebei contained about 12 subunits， and the major subunits were 55.6 kD， 45.9 kD， 34.3 kD， 18.9 kD， 12.4 kD， and 10.5 kD. Conclusion SDS-PAGE technology can be used as one of the references to identify Isatidis Radix in different areas.

Key words：Isatidis Radix；identify；SDS-PAGE

《中华人民共和国药典》规定，正品板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根[1]，主要功效为凉血消肿、清热解毒，研究表明其有抗内毒素的作用[2-3]。由于板蓝根用途非常广泛，产量与市场的供求矛盾使其鉴别和质量受到高度关注。目前中药成分研究主要集中在生物碱、多糖等方面，而对蛋白质等大分子的研究较少。本试验对不同地区的板蓝根蛋白质分子进行指纹图谱研究，以提供不同地区板蓝根药材的更多信息，为其质量控制及进一步研究提供参考。

1 仪器与试药

UV-1700紫外分光光度计，日本岛津；电泳仪和电泳自动成像仪，美国BIO-RAD生化科技有限公司；电

通讯作者：匡海学，E-mail：hxkuang56@163.com

子天平，上海人和科学仪器有限公司；MIKRO220R离心机，德国Hettich。

板蓝根样本采自黑龙江和河北地区，每个地区随机采集10个样本，经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定符合2010年版《中华人民共和国药典》规定，用硅胶干燥，室温保存。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂，BIO-RAD生化科技有限公司；其他试剂为国产分析纯。

2 方法

2.1 蛋白提取

采用植物蛋白提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW2033）进行蛋白提取，所提蛋白可直接进行蛋白电泳分析。①取0.1 g板蓝根，用液氮研磨成细末，转入离心管中。②取990 μL蛋白抽提试剂，在进行蛋白抽提前2～3 min加入10 μL蛋白酶抑制剂。③加入配好的组织蛋白抽提试剂。④冰上孵育20～30 min。⑤10 000×g离心20 min。⑥收集上清，-80 ℃保存备用。

2.2 蛋白定量检测和标准曲线绘制

采用二喹啉甲酸（bicin-choninic acid，BCA）蛋白定量法[4-5]。紫外分光光度仪开机预热20 min。取7只灭菌后的试管（编号1～7），按表1对标准品进行稀释，将稀释好的标准品牛血清白蛋白（BSA）和待测蛋白样品各100 μL分别加入做好标记的试管1～7中，每个样本做3个平行反应。向每个试管中各加入2 mL BCA工作液，充分混匀，室温孵育2 h。将各管冷却至室温。用分光光度计在562 nm处测定样品及BSA的吸光值，分别读取1～7号管的光密度。以蛋白浓度（μg/μL）为横坐标，吸光值为纵坐标，用Excel绘制标准曲线，计算样品中的蛋白含量。

表1 标准品的稀释

管号 BSA（μg） 0.9%氯化钠溶液（μg） 稀释后BSA（μg/μL）

1 100 0 2

2 200 200 1

3 200 200 0.5

4 200 200 0.25

5 200 200 0.125

6 200 200 0.062 5

7 0 200 0

2.3 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白完整性

采用双垂直板SDS-PAGE进行分析[6-8]。分离胶浓度10%，浓缩胶浓度5%，凝胶厚度为1 mm，考马斯亮蓝快速染色（G250）方法進行凝胶染色，染色后的凝胶用 BIO-RAD扫描仪进行扫描，重复3次，并采用Image Lab 4.0.1软件进行图像分析。

3 结果

3.1 标准曲线

为了提高试验的准确性，减少不必要的误差，将1～7号试管在562 nm比色测定3次，求平均值，结果见表2。

表2 比色测定结果

管号 浓度（μg/μL） 吸光值

1 0 0

2 0.062 5 0.022 4

3 0.125 0 0.050 7

4 0.250 0 0.115 3

5 0.500 0 0.207 6

6 1.000 0 0.422 6

7 2.000 0 0.795 7

3.2 板蓝根的蛋白含量

将10个随机样品提取的蛋白进行混合，采用BCA蛋白定量方法测得河北和黑龙江地区板蓝根蛋白含量分别为1.594、2.613 μg/μL。

3.3 蛋白的完整性分析

黑龙江和河北地区板蓝根蛋白亚基分布见图1、图2。染色后板蓝根蛋白质条带清晰，没有拖尾现象，条带颜色越深说明蛋白含量越高，颜色越浅说明蛋白含量越低。从板蓝根蛋白SDS-PAGE图及其亚基分布谱图可以看出，黑龙江板蓝根所含亚基数约为13条，亚基的分子质量范围为10.5～174 kD，其中，黑龙江板蓝根蛋白亚基的最大分子质量为174 kD，最小为10.5 kD，亚基7、9、10、13含量最高。河北板蓝根所含亚基数约为12条，亚基分子质量范围为10.5～173.3 kD，其中，河北板蓝根蛋白亚基的最大分子质量为173.3 kD，最小的为10.5 kD，亚基5、6、7、10、11、12含量最高。蛋白泳道和条带分析见表3～表6。可见，不同地区板蓝根蛋白SDS-PAGE分离效果良好，分辨率高、条带清晰、数量较多，蛋白条带具有多态性，2个地区的板蓝根有相似条带，也有特征条带。

图1 黑龙江地区板蓝根蛋白电泳图谱

图2 河北地区板蓝根蛋白电泳图谱

表3 黑龙江地区板蓝根标准蛋白泳道和条带分析

条带编号 分子量（kD） 相对前沿 体积（lnt） 条带百分比（%） 泳道百分比（%）

1 175.0 0.023 22 022 364 21.6 16.6

2 130.0 0.113 3 491 504 3.4 2.6

3 95.0 0.158 4 935 421 4.8 3.7

4 70.0 0.227 5 134 009 5.0 3.9

5 62.0 0.302 5 500 298 5.4 4.1

6 51.0 0.373 5 208 178 5.1 3.9

7 42.0 0.446 6 001 257 5.9 4.5

8 29.0 0.531 6 305 169 6.2 4.7

9 22.0 0.715 7 693 074 7.5 5.8

10 14.0 0.892 5 876 570 5.8 4.4

11 10.5 0.983 29 813 191 29.2 22.5

表4 黑龙江地区板蓝根蛋白泳道和条带分析

条带编号 分子量（kD） 相对前沿 体积（lnt） 条带百分比（%） 泳道百分比（%）

1 174.0 0.025 24 160 535 24.7 18.1

2 131.0 0.113 137 551 0.1 0.1

3 76.9 0.206 231 887 0.2 0.2

4 66.5 0.259 230 681 0.2 0.2

5 63.7 0.285 334 263 0.3 0.3

6 56.1 0.338 1 037 026 1.1 0.8

7 44.1 0.428 8 150 014 8.3 6.1

8 27.2 0.574 667 722 0.7 0.5

9 24.9 0.632 3 694 112 3.8 2.8

10 23.0 0.687 4 029 782 4.1 3.0

11 15.2 0.859 1 505 624 1.5 1.1

12 13.9 0.894 370 510 0.4 0.3

13 10.5 0.978 53 374 947 54.5 40.0

表5 河北地区板蓝根标准蛋白泳道和条带分析

条带编号 分子量（kD） 相对前沿 体积（lnt） 条带百分比（%） 泳道百分比（%）

1 175.0 0.018 4 219 390 4.4 4.0

2 130.0 0.108 4 061 943 4.2 3.9

3 95.0 0.157 5 697 243 5.9 5.4

4 70.0 0.226 6 982 415 7.3 6.6

5 62.0 0.303 7 892 021 8.2 7.5

6 51.0 0.372 6 400 264 6.7 6.1

7 42.0 0.447 7 513 453 7.8 7.2

8 29.0 0.530 7 327 250 7.6 7.0

9 22.0 0.718 8 925 736 9.3 8.5

10 14.0 0.892 8 137 079 8.5 7.7

11 10.5 0.979 28 744 703 30.0 27.4

表6 河北地区板蓝根蛋白泳道和条带分析

条带编号 分子量（kD） 相对前沿 体积（lnt） 条带百分比（%） 泳道百分比（%）

1 173.3 0.021 5 739 360 9.4 7.1

2 79.5 0.198 164 560 0.3 0.2

3 66.1 0.262 3 169 520 5.2 3.9

4 62.6 0.296 906 960 1.5 1.1

5 55.6 0.341 2 963 200 4.8 3.7

6 45.9 0.413 2 965 200 4.4 3.3

7 34.3 0.493 2 194 080 3.6 2.7

8 26.2 0.599 1 259 760 2.1 1.6

9 23.6 0.671 710 640 1.2 0.9

10 18.9 0.777 3 338 640 5.4 4.1

11 12.4 0.930 8 210 160 13.4 10.1

12 10.5 0.990 29 965 520 48.9 37.0

4 小結

本研究采用双垂直板SDS-PAGE技术对不同地区板蓝根进行研究和分析，该技术具有操作简单、结果可靠、重现性好、样品量少、价格便宜等优点。该技术可以通过比较蛋白图谱，根据蛋白图谱上的蛋白条带数量、分子量大小、条带颜色深浅等对不同地区、不同品种的药材进行鉴别和质量研究。黑龙江地区板蓝根是移栽品种，不同地域土壤酸碱度对植物种植和生长及土壤肥力都有一定影响。本试验为板蓝根药材种植、质量评价，以及进一步深入研究提供了依据。

参考文献：

[1] 曾令杰，杨东升，陈松光，等.板蓝根颗粒的指纹图谱质量控制研究[J].中成药，2004，26（2）：87-89.

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（收稿日期：2014-11-05）

（修回日期：2014-12-26；编辑：陈静）