菠萝蜜种质资源遗传多样性的SRAP分析

吴刚 胡丽松 黄丽芳 郝朝运 谭乐和

中国热带农业科学院香料饮料研究所农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室  海南万宁  571533

摘  要  利用SRAP标记技术，对46份菠萝蜜种质资源进行遗传多样性研究。结果表明：20对SRAP引物组合共扩增出257条带，其中多态性条带194条，多态位点比率为75.5%，平均每对引物扩增条带数和多态性条带数分别为12.9条和9.7条。Shannon 遗传多样性指数I为0.365 7，Neis基因多样性指数H为0.241 4，表明供试样品遗传多样性不丰富。46份菠萝蜜种质间的遗传相似系数在0.674 8～0.975 5之间，平均为0.775 8，说明种质资源的亲缘关系较近。通过UPGMA构建树状图，当相似系数为0.771 0时，菠萝蜜种质资源可分为6个类群，我国的种质资源和东南亚来源的种质相对分开聚类，来源地相同或较近的种质表现出了较为亲密的亲缘关系。

关键词  菠萝蜜;种质资源;遗传多样性;SRAP

中图分类号  S667.8;Q943          文献标识码  A

Analysis of Genetic Diversity in

Artocarpus heterophyllus by SRAP

WU Gang， HU Lisong， HUANG Lifang， HAO Chaoyun， TAN Lehe*

Spice and Beverage Research Institute， CATAS/Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of

Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture，Wanning， Hainan 571533， China

Abstract  In this study， Sequence Related Amplified Polymorphism（SRAP）technique was applied to analyze the genetic diversity of 46 Jackfruit accessions. A total of 257 bands were amplified by 20 selected primer combinations， in which 194 bands were polymorphic， the polymorphic percentage was 75.5%， with an average of 12.9 bands and 9.7 polymorphic bands for each primer combination. The Shannons genetic diversity information index（I）was 0.365 7 and the the Neis gene diversity（H）was 0.241 4， which revealed that the jackfruit accessions had low genetic diversity. The genetic similarity coefficients ranged from 0.674 8 to 0.975 5， with an average 0.775 8. Cluster analysis showed that 46 Jackfruit germplasm were divided into six groups on genetic similarity of 0.771 0. The phylogenetic dendrogram with UPGMA revealed that Chinese accessions and Southeast Asia from relative independent clusters， the germplasm resources coming from the same geographic area presented closer relationship in phylogeny.

Key words  Artocarpus heterophyllus;Germplasm resources;Genetic diversity;SRAP

doi  10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.004

菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）又称木菠萝、树菠萝，为桑科（Moraceae）木菠萝属（Artocarpus）典型的热带果树，原产于印度。在世界上菠萝蜜多分布于东南亚国家，主产国为印度、孟加拉国及马来西亚等。目前在我国海南、广东、台湾、福建、广西和云南西双版纳以及四川南部的热带、南亚热带地区均有种植，其中海南省有近千年栽培历史，为我国菠萝蜜的主产区[1]。菠萝蜜果实甜如蜜、香气独特、营养丰富，含有丰富的糖类、蛋白质、维生素和矿物质等;果实除生食外，还可制作脆片、糕点、饮料等，未成熟果可作各种菜肴的配料;菠萝蜜树体木质细密、色泽鲜黄、纹理美观，是优良的家具和建筑用材[1-2]。自1999年，海南西联农场从马来西亚、泰国引进菠萝蜜种质资源试种，并从中筛选出适合本地生产、综合性状表现较好的马来西亚品种（系）后，近10余年来，菠萝蜜生产发展迅速，种植面积以每年15%左右速度增长，目前种植面积约1.2万hm2，年产量约15万t[3]。随着种植面积的快速增长，生产上因伪劣品种或品系混杂、同名异物、同物异名等造成损失的现象时有发生，菠萝蜜品种（系）在苗期，形态上较相似，传统的形态学鉴定不是很有效。

利用分子标记技术对菠萝蜜种质资源进行准确、科学的鉴定和评价，可为资源保存和育种等工作提供可靠依据。国外，2001年Schnell等[4]利用AFLP标记技术对美国佛罗里达26份菠萝蜜资源进行遗传多样性研究;2008年，印度学者[5]对来自印度不同区域资源进行AFLP多样性分析。国内，叶春海等[6-8]采用RAPD、AFLP等分子标记技术对我国雷州半岛的菠萝蜜种质资源进行了遗传多样性分析，研究结果显示供试种质的遗传多样性处于较低至中等水平，但涉及到菠萝蜜主产区海南的资源量较少。以上研究采用的分子标记，如RAPD标记方法简单、成本低，但重复性低;AFLP标记谱带多、但分析程序复杂、成本高[9]。与其他标记相比， SRAP（Sequence related amplified polymorphism）标记具有操作简单、重复性好、产率高、在基因组中分布均匀，便于克隆目标片段的特点，已经广泛应用于枇杷、柑橘、黑芝麻、木薯、余甘子等[10-15]物种的遗传多样性分析，均表明SRAP 是一种能较好分析种质资源遗传多样性的分子标记技术之一。目前，利用SRAP分子标记技术对菠萝蜜种质资源的研究尚未见报道。本研究利用SRAP 标记对中国热带农业科学院香料饮料研究所（以下简称香饮所）收集保存的46份菠萝蜜种质资源进行遗传多样性分析，探讨其亲缘关系，为我国菠萝蜜种质资源的鉴定、评价以及育种利用提供相关理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

供试的50份材料均种植于香饮所保育基地，包括46份菠萝蜜种质，其中海南种质22份、广东5份、云南4份、马来西亚种质9份、泰国3份、印尼2份以及美国1份;3份尖蜜拉种质（Artocarpus champeden Spreng.）和1份杂交种质（Artocarpus heterophyllus×Artocarpus champeden）。种质资源名称中有“XYS-”种质为20世纪60～80年代，香饮所从海南省各地收集保存的优异资源，树龄30 a以上，其余种质资源为近年收集保存的资源;种质名称之后加“*”为湿胞种质;种质名称JML-1（6）、 JML-2（17）JML-3（19）为尖蜜拉;种质名称MJ（31）为杂交种。具体种质及其来源见表1。

1.2  方法

1.2.1  CTAB法提取DNA   取冷冻新鲜叶片0.3 g放入灭菌研钵中，加入液氮，充分研磨后，倒入离心管中，加入CTAB，65 ℃水中保温1 h，不时摇匀。冷却后离心，上清加入等体积氯仿：异戊醇溶液[24 ∶ 1（V/V）]抽提2次，取上清加1/100 RNase H，37 ℃静置30 min，接着加2倍体积的无水乙醇沉淀，-20 ℃静置1 h，离心后沉淀用70%乙醇洗2次。沉淀晾干后，加入50 mL ddH2O溶解，-20 ℃保存。电泳检测并校定DNA浓度至50 ng/μL，备用。

1.2.2  PCR扩增   SRAP引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列参照齐兰等[14]，引物序列具体见表2。PCR扩增体系和程序参照郑翠芳等[16]的方法并略加修改，PCR扩增体系为20 μL体系，含模板DNA 1μL、10×Buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 1.6 μL、正反向引物各1.2 μL、5 U Taq酶 0.2 μL、ddH2O 12.8 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性l min，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，5个循环;94 ℃变性1 min，53 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物于4 ℃冰箱中保存。SRAP引物及其序列见表2。

1.2.3  电泳检测   PCR扩增产物采用8%变性聚丙烯酰胺凝胶（210 g尿素、1 g甲叉、39 g丙烯酰胺、50 mL 10×TBE，定容至500 mL）进行电泳检测;采用1×TBE作为电泳缓冲液;在20μL SRAP-PCR产物体系中加入6 μL溴酚蓝上样缓冲液（0.125 g溴酚蓝、20 g蔗糖，ddH2O定容至50 mL），上样1.5 μL至点样孔中，120 V恒压电泳1 h。

1.2.4  银染显影   电泳结束后迅速进行银染显影。试验步骤如下：①固定：将电泳完的凝胶放入固定液中（100 mL无水乙醇、5 mL乙酸，ddH2O定容至1 000 mL），固定5 min后取出，蒸馏水清洗1次。② 银染：将固定后的凝胶放入银染液中（0.8 g硝酸银，ddH2O定容至1 000 mL），银染10 min后取出，蒸馏水清洗2次。③显影：将银染后的凝胶放入显影液中（15 g氢氧化钠、10 mL甲醛，ddH2O定容至1 000 mL），直至条带清晰显出，取出凝胶于胶片灯箱上观察拍照。

1.3  数据分析

条带的记录，根据SRAP指纹图谱中Mark的分子量标准估计扩增条带的分子量，每个供试样品的扩增带按有或无记录，“有”赋值为1，“无”赋值为0，得到原始数据表征矩阵，弱带及重复性不好的条带不予统计。将图形资料转换成数据资料，计算单位引物扩增的条带、多态性条带及多态性条带百分率。应用PopGen32软件包计算46份菠萝蜜种质资源的Shannon遗传多样性指数I，Neis基因多样性指数H。用NTSYS pc2.10e分析软件，采用UPGMA聚类方法，对菠萝蜜种质资源进行分析，得到种质间的遗传相似性，并建立样品间的亲缘关系树状图。

2  结果与分析

2.1  SRAP标记多态性分析

用4份种质筛选520对SRAP引物组合，选用20对扩增多态性较好的引物组合对50份种质进行扩增分析。由于菠萝蜜与尖蜜拉是同属不同种的果树，表3结果是基于46份菠萝蜜种质资源扩增结果所统计，尖蜜拉种质以及两种果树的杂交种在遗传相似性和聚类分析中与菠萝蜜种质加以比较。

从表3可得出，20对引物组合对46份菠萝蜜种质资源扩增，共产生257条带，其中多态性DNA条带194条，总多态性条带比率为75.5%，每对引物平均扩增条带为12.9条，引物Me7/Em5组合扩增的总条带数（总位点数）最少6条，引物Me1/Em13和Me2/Em5等2个组合扩增的总条带数最多，均为20条;平均每对引物组合扩增多态性条带9.7条，范围为6～16条，多态性条带比率50.0%～100.0%。Shannon多样性指数评价46份菠萝蜜种质资源的遗传多样性，平均多样性指数I为0.3657，Neis多样性指数H为0.241 4，表明供试样品遗传多样性不丰富。部分试验材料的扩增结果见图1。

2.2  遗传相似性分析

通过对46份菠萝蜜、3份尖蜜拉和1份杂交种，共50份种质的SRAP扩增结果（共扩增出286条DNA带）进行计算其SM相似系数，46份样品中有来自国内海南、云南和广东以及国外马来西亚、泰国、印尼和美国的种质资源。结果表明，46份菠萝蜜种质之间的遗传相似系数变化范围在0.674 8～0.972 8之间，平均相似系数为0.775 8，种质资源的亲缘关系较近，其中来自香饮所的2份种质XYS-Z1（12）和XYS-Z2（13）遗传相似系数最高为0.975 5，其亲缘关系最近;香饮所湿胞种质XYS-13（32）与马来西亚的MLXY-6（20）、MLXY-3（21）资源遗传相似系数都最低为0.674 8，亲缘关系最远。杂交种与46份菠萝蜜种质的平均遗传相似系数为0.747 1，杂交种与3份尖蜜拉种质的平均遗传相似系数为0.698 1，表明杂交种与菠萝蜜种质亲缘关系较近。来自印尼、马来西亚和台湾的3份尖蜜拉种质平均相似系数为0.701 6，表明3份种质间存在一定的遗传变异。

2.3  聚类分析

UPGMA法构建的聚类分析树状图，在遗传相似系数为0.745 0处时，46份菠萝蜜种质资源和3份尖蜜拉及1份杂交种明显区分开，其中菠萝蜜种质归为一大类，来自马来西亚的JML-2（17）和杂交种（31）归为一起，来自印尼JML-3（19）和台湾JML-1（6）的尖蜜拉归为一起;在遗传相似系数为0.771 0处时菠萝蜜种质又可分为6个亚类，见图2。

图2中，一亚类共19份资源：包括海南香饮所收集保存资源11份、海南万宁南桥1份、广东资源5份、云南资源2份;二亚类主要是来自香饮所收集保存的8份资源，分别是XYS-HM（33）、XYS-BD1（36）、XYS-MP（37）、XYS-BD2（35）、XYS-12（39）、XYS-YHT（41）、XYS-S3*（42）和XYS-3（34）;三亚类包括4份资源，来自印尼的YDNXY（5）与HCY（7）、马来西亚的MLXY-9（4）以及美国佛罗里达州FL（9）; 四亚类包括11份资源，有8份种质资源来自马来西亚，3份来自泰国，其中泰国资源先明显聚在一起，再和其他马来西亚资源聚为同一亚类;五亚类包括3份资源，来自云南德宏州瑞丽的YN-2（8）、德宏州盈江县的YN-3（30）和来自海南文昌的DLNC（45）;六亚类仅包含一份材料，香饮所收集的XYS-Y1（10）。

从图2还可得出，一亚类19份资源二亚类8份资源先聚为一起，这27份资源都来自中国;三亚类4份资源四亚类11份资源也先聚为一起，这15份资源除了1份来自美国佛罗里达外，其余14份都来自泰国、马来西亚和印尼等东南亚国家。此外从树状图还可得出，4份湿胞种质XYS-S1*（29）、XYS-S2*（32）、XYS-S3*（42）、XYS-S4*（50）与其他干胞种质混杂聚类在一起。

3  讨论与结论

本研究采用SRAP分子标记方法对46份菠萝蜜种质资源DNA的遗传多样性进行检测，20对引物组合共产生257条重复性好、稳定性高的条带，且能把46份种质分开，说明了SRAP分子标记技术在菠萝蜜品种资源鉴定中的可行性。利用分子标记技术可克服基于形态学、品种鉴定过程中出现的种种不足。

Shannon多样性指数评价46份菠萝蜜种质资源的遗传多样性，平均多样性指数I为0.365 7，Neis多样性指数H为0.241 4，表明供试样品在DNA水平的遗传多样性低。遗传相似系数变化范围在0.674 8～0.975 5之间，平均遗传相似系数为0.775 8，表明本研究中来自我国海南、广东和云南的菠萝蜜种质资源和来自泰国、马来西亚、印尼等东南亚地区的种质资源在DNA水平上的遗传相似度高，遗传背景较狭窄。本研究采用的种质，以海南种质为主（22份），但研究结果与叶春海[6-7]对以雷州半岛菠萝蜜种质资源为主的遗传多样性研究结果类似，菠萝蜜平均遗传相似系数分别为0.734 1（RAPD）、0.775 0（ISSR），遗传多样性低、遗传相似度高。表明目前我国收集、保存的菠萝蜜资源遗传多样性不高，建议从菠萝蜜原产地引进资源以丰富遗传多样性。此外，香饮所湿胞种质XYS-13（32）与马来西亚来源的MLXY-6（20）、MLXY-3（21）资源遗传相似系数都最低为0.674 8，亲缘关系最远，因而在选择亲本进行杂交组合育种时，选择亲缘关系远的种质资源，更有利于杂交后代的遗传性状改良。

聚类分析时，选取尖蜜拉和杂交种作为外类群验证，在遗传相似系数为0.745 0处时，46份菠萝蜜种质资源和3份尖蜜拉及1份杂交种明显分开。从聚类图中可看出，在遗传相似系数为0.771 0处时，46份菠萝蜜种质又可分为6个亚类，6个亚类种质资源聚类虽不能按地区来源单独聚类，但大多数来源地相同或较近的种质表现了较为亲密的亲缘关系，呈现一定的地区性差异，如一亚类和二亚类的菠萝蜜资源先聚类，主要包含我国海南、广东和云南的资源;三亚类和四亚类等东南亚地区的资源也优先聚为一起（其中1份资源来自美国）。印度学者[5]对本国菠萝蜜资源基于AFLP分子标记的聚类分析时也发现，资源聚类和来源地、形态性状高度一致。本研究也发现一些较为特殊的个类，如六亚类仅包含一份材料，香饮所收集的XYS-Y1（10），说明该份资源有着较为特殊的遗传背景。湿胞种质与其他干胞种质不能独立聚类，SRAP分析的结果与前人利用ISSR和RAPD标记得到结果类似，均不能区分湿胞、干胞种质[6-7]。这可能与所用SRAP引物有限，没有扩增出湿胞、干胞的特异位点有关。

丰富的遗传多样性是物种适应外界环境变化的物质基础，农业生产上应用的作物品种类型愈丰富愈能抵御变化莫测的自然灾害。综合Shannon多样性指数、Neis多样性指数和遗传一致性结果得出，供试菠萝蜜种质资源遗传多样性较低，在资源保存和遗传育种中需要进一步拓宽资源多样性和遗传背景，如引进来自印度的资源或者菠萝蜜属的野生近缘种，并进一步加强资源研究的广度和深度，将利于促进我国菠萝蜜种质资源的创新和新品种选育。

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