叶子花属植物的组织培养研究进展

陈影 曹武 曾宋君

摘  要  叶子花属植物的组织培养是其种苗繁殖最有效的手段之一，同时，还能为其性状改良提供有效的遗传转化系统。从叶子花组织培养外植体的选择、基本培养基类型、植物生长调节物质的选择和组培苗的移栽等方面综述了叶子花组织培养的研究现状，并详细介绍了叶子花组织培养的再生方式和影响因素，最后，探讨了叶子花组织培养研究中存在的问题以及未来的研究和发展方向。

关键词  叶子花;组织培养;外植体;培养基;植物生长调节剂

中图分类号  S685.99          文献标识码  A

Tissue Culture Advances of Bougainvillea

CHEN Ying1，2， CAO Wu2， ZENG Songjun1*

1 Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement，

South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou， Guangdong 510650， China

2 Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou， Guangdong 510225， China

Abstract  Tissue culture is one of the most effective means of rapid propagation of Bougainvillea， which also can provide an effective genetic transformation system for character improvement. This paper summarized the advances of Bougainvillea tissue culture， including explant types， basic medium， plant growth regulators， and introduced the regeneration methods and influence factors of Bougainvillea tissue culture. In addition， main problems in Bougainvillea tissue culture were analyzed， the research and development direction in the future was also discussed.

Key words  Bougainvillea;Tissue culture; Explants;Medium;Plant growth regulator

doi  10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.029

叶子花 （Bougainvillea）又称三角梅、三角花、九重葛、勒杜鹃、簕杜鹃、宝巾、宝荆等，紫茉莉科叶子花属常绿藤本植物。该属植物约有14～18个种，300多个品种，原产于南美巴西附近的沿海岛屿。中国引种栽培的叶子花有3个原生种、1个自然杂交种和100多个品种。3个原生种为叶子花（B. glabra Choisy）、毛叶子花（B. spectabilis Willd）和秘鲁叶子花（B. peruviana Bonpl.），自然杂交种为叶子花和秘鲁叶子花杂交的布蒂娜叶子花（B. x buttiana Holttum & Standl）[1-4]。由于叶子花品种丰富，生命力强，栽培适应范围广，且花色丰富、花期长，是应用广泛的园林绿化植物和盆栽花卉[5-6]，此外，它还含有对人类健康以及环境保护有积极作用的化学物质，如天然色素和黄酮等[7-13]。叶子花是赞比亚的国花，也是中国海南省海口、三亚，广东省深圳、惠州、江门、中山、 珠海，福建省厦门、三明、惠安，广西壮族自治区北海、梧州，云南德宏、临仓、宜良，贵州黔西南，浙江洞头和台湾省屏东等18市的市花[2]。叶子花属植物，特别是栽培品种在我国栽培时极难结实，其常规繁殖常采用扦插，有时采用嫁接和压条，但叶子花的常规繁殖增殖系数较小、生根时间较长、繁殖时间受季节限制等不利因素的影响[14-19]，而对于一些数量稀少的新品种及一些扦插繁殖生根难的品种，采用传统的扦插繁殖方法繁殖难以在短时间内获得大量种苗满足市场需求。而组织培养快速繁殖技术能够在短期内获得基因型一致的大量的优质苗木，并能保持母株的优良特性且防止品种退化，同时种苗生产不受季节的限制，是一种有效的苗木规模化的繁殖方式。另外，建立叶子花的植株再生体系，还能为其性状改良提供有效的遗传转化系统。全世界对叶子花属植物的组织培养已进行了较多的研究[20-44]，本文对这些文献进行综述， 以期为以后叶子花属植物组织培养的研究和生产应用提供有价值的参考。

1  组织培养的品种及外植体的选择

1.1  组织培养概况

叶子花组织培养研究的最早报道是1978年Chaturvedi等[21]和1981年Sharma等[24]以茎尖为外植体，成功地对叶子花品种B. glabra ‘Magnifica进行了不定芽的诱导和生根培养并移栽到大田获得与亲本性状一致的正常开花的植株。中国最早关于叶子花组织培养的报道是 1983年谭文澄[37]利用叶子花的侧芽进行的。在全世界能检索到的24篇有关叶子花属植物的组织培养中，有关叶子花（B. glabra）的论文10篇，有关毛叶子花（B. spectabilis）的论文9篇，有关布蒂娜叶子花（B. x buttiana）的论文1篇，以及同时进行2个或以上品种的论文4篇[20-44]。Duhoky和Al-Mizory[22]的研究结果表明，杂交种布蒂娜叶子花的组织培养比原生种叶子花和毛叶子花要容易得多，无论是愈伤组织的诱导、不定芽的分化还是生根都表现出较大的优势。布蒂娜叶子花在最适愈伤诱导培养基WPM[45]+2.0 mg/L BA（6-苄氨基腺嘌呤）+0.2 mg/L NAA（萘乙酸）上的诱导率为92.86%，叶子花和毛叶子花为71%和82.4%;而它们的器官发生率分别为96.43%、78.57%和89.29%。程治英[27]以叶子花4个品种的带腋芽的未木质化的茎段为外植体进行不定芽的诱导时，也发现杂交种（Red and White）比原生种叶子花和毛叶子花更易进行组织培养。而张小红等[42]发现红色叶子花和紫色叶子花最适的芽诱导和增殖培养基不同，紫色品种的最适培养基为MS+1.0 mg/L BA+0.4 mg/L NAA，红色品种的最适培养基为MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA。

1.2  外植体的选择和灭菌

目前，已报道叶子花组织培养中所采用的外植体主要有茎尖、茎段、侧芽、叶片、花器官等，其中最常用的是茎尖和茎段。外植体灭菌最常采用的方法是75%的酒精浸泡30～60 s，无菌水冲洗3～5次后，再用0.1%的 HgCl2溶液浸泡8～12 min，最后用无菌水冲洗5～8次。周俊辉等[43]为了提高外植体灭菌的成功率，将带健壮腋芽的半木质化枝条剪成4～5 cm的小段后先用1%的洗衣粉水浸泡30 min，流水冲洗后，再用100 mg/L的庆大霉素溶液浸泡30 min再进行常规消毒。孙利娜等[36]对叶子花（B. glabra）的不同外植体消毒和愈伤组织诱导进行了较为系统的研究。他们选择生长健壮无病虫害的叶子花的花、苞片、茎尖、叶片、叶柄、幼嫩茎段、半木质化茎段作为外植体，采用75%的酒精灭菌25～35 s，再用0.1%升汞消毒7～11 min。消毒效果由好到劣的外植体依次为半木质化茎段>幼嫩茎段>叶柄>叶片>苞叶、花、顶芽。其中苞叶、花、顶芽未成功获得既未污染又成活的外植体。其它4种外植体中，最佳消毒方法为先用浓度75%酒精溶液灭菌30 s，无菌水冲洗5次后，再用0.1%升汞溶液消毒9 min，最后用无菌水冲洗7～8次;同时，他们研究发现而不同外植体具有不同的愈伤组织诱导能力，其中最佳外植体为半木质化茎段，它在最佳的愈伤组织诱导培养基MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA培养基上，愈伤组织的诱导率达90.6%，而幼嫩茎段、叶片、叶柄分别为75%、62.5%、12.5%。叶顶英和张健[39]在对叶子花的茎尖、茎节和叶片进行不定芽的诱导时发现，它们的再生能力表现为茎尖>茎节>叶片。杜天奎和徐青[29]以茎尖和茎节为外植体进行不定芽的诱导和增殖时，发现毛叶子花茎尖的最佳诱导和增殖培养基为MS+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L NAA，而茎节的最佳诱导和增殖培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA（吲哚丁酸）。

2  基本培养基及生长调节物质选择

2.1  基本培养基

叶子花组织培养研究中最常采用的基本培养基是MS[46]、1/2 MS和1/4 MS（其中1/2 MS和1/4 MS多用于生根培养），也有采用WPM和B5[47]等作为基本培养基的报道[22，30]。Duhoky和AL-Mizory[22]对布蒂娜叶子花、叶子花和毛叶子花的愈伤组织诱导、器官发生和生根在以WPM和MS为基本培养基的组织培养情况进行了研究，布蒂娜叶子花、毛叶子花在WPM培养基上比在MS培养基上的愈伤组织诱导、器官发生方面均表现出较好的效果，叶子花的器官发生同样表现出较好的效果，但愈伤组织诱导率差异不大。而在生根培养方面，除布蒂娜叶子花在1/4 WPM和1/4 MS上的生根率均为100%外，其它2个种类及蒂娜叶子花在1/2 WPM培养基和1/4 WPM上比在1/2 MS培养基和1/4 MS上均表现出较好的效果。龚伟等[30]报道叶子花茎段愈伤组织的诱导和分化效果在MS培养上比在1/2 MS和B5培养上好。

2.2  生长调节物质选择

在叶子花的组织培养中，常用的植物生长调节剂有BA，2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），IAA（吲哚乙酸），IBA和NAA。KT和2，4，5-三氯苯氧基乙酸也曾被用于叶子花的组织培养中。Chaturved等[21]和Sharma等[24]报道在改良的MS培养中加入KT（激动素）时，不能诱导不定芽的产生，仅在高浓度时产生愈伤组织;而在培养基中加入2，4，5-三氯苯氧基乙酸有利于叶子花的生根。

2.2.1  愈伤组织的诱导和分化   叶子花的组织培养目前多采用丛生芽繁殖。但叶子花在组织培养过程中，外植体基部常会产生愈伤组织，多被切除丢弃而未进行增殖和分化出芽实验。有关叶子花愈伤组织的诱导论文只有3篇，而利用愈伤组织分化出苗只有龚伟等[30]进行了报道，其研究表明，光叶子花（B. glabra）茎段在MS+3.0 mg/L BA+0.2 mg/L 2，4-D+mg/L NAA 0.1培养基的培养效果取好，愈伤组织的诱导率和分化率分别达78.2%和25.6%。孙利娜等[36]对叶子花（B. glabra）的不同外植体消毒和愈伤组织诱导进行了较为系统的研究。发现6-BA在叶子花的愈伤组织诱导中起着非常重要的作用，浓度为0.5～2.0 mg/L均可诱导出愈伤，比2，4-D的效果更好，在培养基中添加NAA时具有一定的促进作用。杜天奎和徐青[29]报道毛叶子花叶片愈伤组织的最佳诱导培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D。

2.2.2  不定芽诱导增殖培养    叶子花不定芽的诱导增殖有时会使用同一种培养基，有时会有所差别。MS或改良的MS培养中附加BA是最常见的，大多数的情况下还会附加NAA、IAA或IBA。BA和NAA、IAA或IBA的浓度范围从0.2 mg/L至2.0 mg/L。Chaturvedi等[21]报道，叶子花的最佳诱导培养基为改良的MS+0.2 mg/L BA+1.0 mg/L IAA，而最佳的增殖培养基为改良的MS+0.5 mg/L BA+1.5 mg/L NAA。谭文澄[37]报道，叶子花不定芽的最佳诱导培养基为改良的MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+5 000 mg/L水解乳蛋白，而最佳的增殖培养基为改良的MS+1.0 mg/L BA+1.5 mg/L IAA+10 mg/L 腺嘌呤+10 mg/L硫铵素。Javed等[23]报道毛叶子花最佳诱导培养基为改良的MS+0.25 mg/L BA+0.25 mg/L NAA，最佳的增殖培养基为改良的MS+2.0 mg/L BA+0.1 mg/L NAA+250 mg/L谷氨酸。周俊辉[43]报道毛叶子花最佳诱导培养基为MS+0.2 mg/L BA+1.0 mg/L IAA，而最佳的增殖培养基为MS+0.5 mg/L BA+1.5 mg/L NAA。在不定芽诱导和增殖采用的同一种培养基的研究中张波等[41]报道叶子花的最佳诱导和增殖培养为MS+1.0 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，不定芽的增殖倍数可达到12;郭海滨等[31]报道叶子花最佳诱导和增殖培养为MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA;李师翁等[34]报道毛叶子花的最佳诱导和增殖培养为MS+0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA。

2.2.3  生根培养   叶子花的生根率较低，在生根过程中有时会伴随愈伤组织的产生。而不同的叶子花品种的生根培养基不同。叶子花生根实验中培养中常使用的生长调节物质有IBA、NAA和IAA，这3种激素均能诱导叶子花生根，是单独使用还是混合使用更有利于叶子花的生根目前还没有统一的结论。Duhoky和AL-Mizory[22]对布蒂娜叶子花、叶子花和毛叶子花的生根研究发现，布蒂娜叶子花比叶子花和毛叶子花具有更高的生根率，它在1/4 WPM和1/4 MS上的生根率均为100%，而叶子花和毛叶子花在1/4 WPM培养基上比1/4 MS培养基上具有更高的生根率，叶子花的生根率分别为89.29%和82.14%，毛叶子花的生根率分别为96.43%和85.71%。叶顶英[38]在以1/2 MS、3/8 MS和1/4 MS为基本培养附加不同浓度的IBA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、NAA（0、0.05、0.1 mg/L）和活性炭（0、0.5、1.0 mg/L）进行正交实验的培养基上，获得的最高生根率的培养基为1/4 MS+1.5 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA，生根率达92.53%。杜天奎和徐青[29]发现毛叶子花的最佳诱导培养基为1/2 MS+0.3 mg/L NAA。Shah等[25]发现毛叶子花品种‘Texans Dawn的最佳生根培养基为1/2 MS+2.5 mg/L NAA+2.5 mg/L IBA。Ahmad等[20]发现两步法最有利于生根，即先将无根的小苗培养在1/2 MS+5.0 mg/L IAA+5.0 mg/L IBA 培养基上培养后再在1/2 MS+0.5 mg/L IAA+0.5 mg/L IBA培养。Javed等[23]报道毛叶子花品种‘Texans Dawn在改良的MS培养基+5.0 mg/L NAA+5.0 mg/L IBA培养基上，生根率可达70%。

利用愈伤组织分化获得的试管苗由于较瘦弱，在生根培养前需要进行壮苗培养。龚伟等[20]报道壮苗培养基以MS+0.2 mg/L BA+0.5 mg/L GA3+0.1 mg/L NAA的效果最好，经过壮苗培养的小苗在MS+3.0 mg/L NAA培养基上生根率达到88.3%。

由于一些叶子花的组培苗试管内不生根，同时为了降低试管苗的生产成本，可进行试管苗的试管外生根。叶顶英[38]报道，叶子花在20 ℃～25 ℃，基质水分及空气湿度控制在60%～90%，有较强的散射光的条件下，利用25、50、100 mg/L的IBA和ABT处理均能生根。在ABT浓度为50 mg/L效果最佳，试管外生根率为可达43%。

3  培养条件

已报道叶子花的培养温度范围为20 ℃～30 ℃，其中23 ℃～27 ℃应用最多[20-44]。光照范围1 000～4 000 lx，多为1 500～3 000 lx。韩建军[32]对叶子花的顶芽和带腋芽的茎段进行组织培养时发现培养条件与玻璃化具有较大的相关性。在MS培养基中附加0.2、0.5和2.0 mg/L BA时，随着BA浓度的升高，外植体玻璃化的比率升高。而在高温（35 ℃）和阴暗的弱光培养条件下也易产生玻璃化。

4  组培苗的移栽

组培苗移栽是关系到能否实现工厂化育苗的关键，目前对叶子花组培苗移栽报道的主要是从基质、移栽温度和湿度方面的研究。张波等[41]报道叶子花试管苗在选用基质为翻晒过的河沙与腐殖土作基质时，在腐殖土上的移栽成活率为96%，而在河沙上仅为85%。龚伟等[30]报道将发育良好的生根苗移出培养室，在室温散射光下培养3 d，打开封口膜于温室大棚中预2 d，洗去根部培养基，移栽于经福尔马林消毒的河沙和蛭石（1 ∶ 1）为基质的小花盆中，置于半荫处，并用地膜覆盖保湿10 d，每天揭开地膜通风30 min，注意浇水，15 d后去除遮荫网直接在自然条件下生长，30 d时成活率可达90%以上。李师翁[34]采用二步法移栽，即先铺5 cm厚珍珠岩制作苗床，将生根苗洗净培养基液后，均匀移入苗床，搭设塑料棚，并加遮阳网，使棚内光强在10 000 lux以下，保持湿度85%以上，温度35 ℃以下，严格管理约4～5周后成活，然后将成活苗移入配制机制的营养钵中再进行常规管理，平均成活率达97%以上。

程治英[27]报道，试管苗的开花比扦插苗早，扦插苗开花约需2 a时间，而试管苗双色叶子花（B. Red and white）移栽后83 d就开了花，多花叶子花（B. double）95 d开花，单花的毛叶子花（B. spectabilis）150 d开花。

5  问题与展望

国内外叶子花的组织培养技术已经有了一定的基础，但还没有形成一个比较完善的技术体系，较少应用于实际生产。其主要原因有：（1）外植体表面灭菌污染率高;（2）组织培养过程中易产生愈伤组织而愈伤组织又难再生植株;（3）生根困难;（4）移栽成活率较低;（5）生产成本较高。这些都是实现叶子花工厂化育苗的瓶颈。针对外植物体污染的问题，可以采用3个方面的措施进行防止：①对母株进行预处理，采集外植体时尽量选取带菌少的材料;②采用合适的消毒方法，如给外植体消毒的时候，一般使用酒精和升汞结合的消毒方法[48]，还有一些比较特殊的方法，如减压灭菌法[49]、臭氧消毒法[50]、间隙消毒法[51]、超声波振动灭菌等[52];③培养基中加放适量抗生素等抗菌剂[48，52]。针对组织培养过程中易产生愈伤组织而愈伤组织难再生植株的问题，我们可从两个方面进行解决。如果是进行优良品种的种苗生产，可通过采用培养基的优化、改变培养条件等方法尽量减少愈伤组织的产生，而如果需要进行叶子花的转基因技术研究时，由于通过愈伤组织再生植物途径是最有效的方式，我们同样可以通过培养基的优化和改变培养条件等方法建立高效的愈伤组织再生体系。对于叶子花组织培养过程中生根难度大的问题，我们可以在优化培养基和培养条件的基础上，采用滤纸桥等方式等进行生根诱导[53]或进行体细胞胚的诱导[54-55];也可以采用两步生根法进行生根诱导，即先在含有生长素的生根诱导培养基上诱导生根，再转移到不含激素但含活性碳的培养上完成根的生长[48，56]。对于移栽成活率低的问题，可通过炼苗，严格控制移栽环境的温湿度来提高移栽的成活率。如果生产的品种是优良品种且规模较大，并且有高效的再生体系，生产成本自然也会大幅度降低而在市场上具有竞争力。总之，在以后的工作中， 要加强叶子花不同品种组织培养技术体系的研究， 获得针对不同品种的高效、实用、标准的组培快繁体系;其次，在外植体处理及不定芽的诱导、增殖分化、生根壮苗等各个阶段，对基本培养基类型、植物生长调节物质、培养基中添加物的选择、培养条件等方面进行优化。

此外， 在叶子花组培快繁体系的基础上， 应拓宽研究方向。如在建立稳定的叶子花再生体系的基础上，通过诱变技术或转基因技术培育叶子花新品种。目前，世界上叶子花的新品种选育主要通过芽变选种来实现的，也有通过物理和化学诱导选育新品种的报道[57-61]。叶子花的芽变选种即是从发生优良芽变的植株上选取变异部分的芽或枝条，用无性繁殖的方法使变异性状得到延续和固定，经过初选、复选、决选等程序的选择、观察和鉴定，最后选出优良株系育成新品种[57]，而物理和化学诱导也能获得叶型、叶色、花型、花色变化的植株[58-61]。由于获得的新品种材料常常稀少，采用组织培养技术进行种苗大规模繁殖是最有效的方法。同时，利用转基因技术可以定向地在基因水平上进行植物性状的改变，如培育出抗盐碱、抗寒、耐涝等抗逆性强的品种，以扩大叶子花在北方和恶劣环境的栽植面积;改变叶子花的叶型、叶色、花型、花色或延长花期并培养出具有芳香的品种， 而基因工程技术更是建立在以组织培养为基础的有效转化体系的基础上。

参考文献

[1] 傅立国. 中国高等植物[M]. 青岛：青岛出版社， 2003， 6： 564-576.

[2] 周  群. 中国叶子花属植物种质资源及其繁殖技术研究[J]. 中国农学通报， 2008， 24（12）： 321-324.

[3] 周  群， 黄克福， 丁印龙，等. 中国引栽三角梅属观赏品种的调查与分类鉴定[J]. 江西农业学报， 2011， 23（5）： 53-56.

[4] 唐玉贵， 朱积余， 刘志仁，等. 宝巾花品种资源收集与繁殖技术[J]. 广西林业科学， 2007， 36（1）： 225.

[5] 赵玉梅， 任红梅. 我国叶子花属植物的应用前景及展望[J]. 安徽农业科学， 2011， 39（10）： 5 697-5 698.

[6] 武晓燕， 唐源江. 三角梅属植物种质资源及其园林应用研究进展[J]. 南方农业， 2010， 4（10）： 40-43.

[7] 江苏新医学院. 中药大辞典[M]. 上海： 上海人民出版社， 1977.

[8] Narayanan C R， Joshi D D， Mujumdar A M， et al. Pinitola new anti-diabetic compound from the leaves of that our greenhouse-grown plants were about double Bougainvillea spectabili[J]. Curr Sci， 1987， 56： 139-141.

[9] 谢启明， 罗  琴. 叶子花天然红色素的提取及性能研究[J]. 楚雄师专学报， 2000， 15（3）： 93-97.

[10] 陈  林， 包季全，蒋  晟. 叶子花色素的提取及性质研究[J]. 云南民族学院学报（自然科学版）， 1997， 6（1）： 40-43.

[11] 刘艳清， 鲁湘鄂，张  广. 叶子花中总黄酮提取方法研究[J]. 中药材， 2007， 30（3）： 333-335.

[12] 徐夙侠， 林春松， 黄青云， 等. 3个三角梅品种中类黄酮的毛细管电泳分析比较研究[J]. 植物研究， 2010， 30（6）： 718-724.

[13] 徐夙侠， 黄青云， 刘鸿洲， 等. 光叶三角梅‘Formosa 叶片挥发性组分的GC-MS 分析[J]. 亚热带植物科学， 2009， 38（4）： 5-8.

[17] 周贱平， 卢俊鸿，廖伟清. 基质和植物生长调节剂对九重葛插条生根的影响[J]. 园艺学报， 1994， 21（2）： 205-206.

[15] Cerveny C B， Gibson J L. Influence of indolebutyric acid potassium salt on propagation of semi-hardwood stem cuttings of Bougainvillea[J]. HortScienc， 2006， 41（4）： 983.

[16] Lai R Y， Zhong Z H， Zhang X Q， et al. Effects of remaining leaf combining with IBA on rooting， physiological and biochemical indicators of leaves from Bougainvillea spectabilis Cuttings[J]. Agric Sci and Technol， 2010， 11（7）： 120-123.

[17] 钟赞华， 谢志南， 张雪芹，等. 遮光对三角梅插穗生根及光合作用的影响[J]. 安徽农业科学， 2010， 38（30）： 16 748 -16 750.

[18] 林丽仙， 谢志南， 苏明华，等. 静电场对三角梅插穗生根及几种生理生化指标的影响[J]. 热带作物学报， 2010， 31（10）： 1 730-1 735.

[19] 谢志南， 钟赞华，赖瑞云. 基质温度对三角梅插穗生根及其叶片光合作用的影响[J]. 广西植物， 2011， 31（2）： 222-226.

[20] Ahmad I， Lutfullah G， Zamir R， et al. In vitro response of various growth regulators on the regeneration of Bougainvillea spectabilis Willd[J]. Suranaree J Sci Technol， 2007， 14（2）：157-162.

[21] Chaturvedi H C， Sharma A K， Prasad RN. Shoot apex culture of Bougainvillea glabra cultivar Magnifica[J]. Hortscience， 1978， 13（1）： 36.

[22] Duhoky MMS， Al-Mizory LSM. In vitro Micropropagation of selected Bougainvillea sp. through callus induction[J]. IOSR J Agric Veterinary Sci， 2014， 6（6）： 1-6.

[23] Javed A M， Said H， Saima N. In vitro propagation of （Bougainvillea spectabilis）through shoot apex culture[J]. Pak J Bot， 1996， 28（2）： 207-211.

[24] Sharma A K， Prasad R N， Chaturvedi HC. Clonal propagation of Bougainvillea glabra‘Magnificathrough shoot apex culture[J]. Plant Cell Tissue Organ cult， 1981（1）： 33-38.

[25] Shah S T， Zamir R， Muhammad T， et al. Mass propagation of Bougainvillea spectabilis through shoot tip culture[J]. Pak J Bot， 2006， 38（4）： 953-959.

[26] Sinha P， Rahman A， Roy SK. Micropropagation of Bougainvillea buttiana Hol. & Standley[J]. Plant tissue Cult， 1997， 7（2）：117-124.

[27] 程治英. 几种叶子花的组织培养[J]. 植物杂志， 1987（4）： 3.

[28 董永义， 宋  旭，郭  圆. 盆栽三角梅的组织培养[J]. 北方园艺， 2008（6）： 179-180.

[29] 杜天奎， 徐  青. 叶子花的组织培养[J]. 宁夏大学学报（自然科学版）， 2004， 25（1）： 69-71.

[30] 龚  伟， 胡庭兴， 宫渊波，等. 光叶子花茎段愈伤组织的诱导及其植株再生的研究[J]. 园艺学报， 2005， 32（6）： 1 125-1 128.

[31] 郭海滨， 代汉萍， 雷家军. 叶子花组织培养技术研究[J]. 安徽农业科学， 2006， 34（1）： 13-14.

[32] 韩建军. 叶子花组织培养中培养条件与玻璃化的相关性[J]. 中国林业副特产， 2002， 60（1）： 48.

[33] 李师翁. 叶子花的组织培养与快速繁殖[J]. 植物生理学通讯，2000， 36（3）： 230-230.

[34] 李师翁， 范小峰， 田兴旺，等. 叶子花的组织培养与微繁技术研究[J]. 西北植物学报， 2003， 23（6）： 992-996.

[35] 沈清景. 白色叶子花的组织培养[J]. 植物生理学通讯， 1987（3）： 40.

[36] 孙利娜， 龙定建， 王华新，等. 三角梅外植体消毒和愈伤组织诱导研究[J]. 安徽农业科学， 2011， 39（20）： 12 024-12 025， 12 055.

[37] 谭文澄. 叶子花的侧芽培养[J]. 植物生理学通讯， 1983（1）： 28.

[38] 叶顶英. 三角梅组培苗试管内外生根研究[J]. 北方园艺， 2011（15）： 169-171.

[39] 叶顶英， 张  健. 三角梅组织培养外植体再生体系建立研究[J]. 四川农业大学学报， 2004， 22（2）： 142-145.

[40] 沈清景. 白色叶子花的组织培养[J]. 植物生理学通讯， 1987（3）： 40.

[41] 张  波， 刘小林， 田振东. 叶子花组培试验研究[J]. 甘肃林业科技， 1999， 24（4）： 29-30.

[42] 张小红， 常美花，张俊花. 叶子花组织培养育苗技术研究[J]. 张家口农专学报， 2000， 16（2）： 25-26.

[43] 周俊辉， 曾洁娴， 黄宇珊. 勒杜鹃无菌系的建立与试管开花诱导的研究[J]. 西南大学学报（自然科学版）， 2009， 31（4）： 73-78.

[44] 周先容. 叶子花的组织培养及快速繁殖研究[J]. 重庆师范学院学报（自然科学版）， 2003， 20（3）： 48-49.

[45] Lloyd G， Mccown B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel， Kalmia latifolia， by use of shoot-tip culture[J]. Combined Proceedings-International Plant PropagatorsSociety， 1981（30）： 421-427.

[46] Murashige T， Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J]. Physiol Plant， 1962（15）： 473-497.

[47] Gamborg O L， Miller R A， Ojima K. Nutrient requirements of suspension culture of soybean root cells[J]. Exp Cell Res， 1968， 50（1）： 151-158.

[48] Wu K L， Zeng S J， Chen Z L， et al. In vitro mass propagation of hermaphroditic Carica papaya cv. Meizhonghong[J]. Pakistan Journal of Botany， 2012， 44（5）： 1 669-1 676.

[49] 周俊辉， 刘花全， 罗慧君，等. 玛丽安万年青茎段培养的污染防治[J]. 仲恺农业技术学院学报， 2002， 15（4）： 43-48.

[50] 焦立为， 黄克梅， 焦立群. 植物组织培养前用臭氧对外植体进行消毒灭菌的效果初探[J]. 植物生理学通讯， 2002， 38（5）： 466.

[51] 朱广廉. 植物组织培养中的外植体灭菌[J]. 植物生理学通讯，1996， 32（6）： 444-446.

[52] 马  燕， 韩瑞超， 臧德奎，等. 木本观赏植物组织培养研究进展[J]. 安徽农业科学， 2012， 40（4）： 1 956-1 958， 2 036.

[53] 孙仲序， 王玉军， 刘  静，等. 植物组培快繁滤纸桥生根新技术[J]. 山东农业大学学报（自然科学版）， 2002， 33（3）： 257-263.

[54]崔凯荣， 戴若兰. 植物体细胞胚发生的分子生物学[M]. 北京： 科学出版社， 2000.

[55] Santana N， Conzalez M E， Valcarcel M， et al. Somatic embryogenesis： a valuable alternative for propagating selected robusta coffee（Coffee canephora）clones[J]. In Vitro Cell. Dev. Biol. 2004， 40（1）： 95-101.

[56] 张红晓， 经剑颖. 木本植物组织培养技术研究进展[J]. 河南科技大学学报（农学版）， 2003， 23（3）： 66-69.

[57] 缪林海， 周  群， 丁印龙，等. 三角梅的变异性及其新品种选育[J]. 安徽农学通报， 2013， 19（01-02）： 102-103， 131.

[58] 邓  红， 刘绍德. 叶子花辐照诱发突变育种的研究[J]. 华南农业大学学报， 1990， 11（1）： 89-93.

[59] 陈  庭， 范雅文， 刘  伟. Co60-γ射线诱变宝巾（Bougainvillea）的生物学效应研究[J]. 河南农业科学， 2012， 41（6）： 133-136.

[60] 孙利娜， 王华新， 龚建英. 宝巾花辐射诱变效应研究初报[J]. 北方园艺， 2013（19）： 91-93.

[61] 陈  庭， 王爱敏， 刘运权， 等. NaN3对宝巾的诱变效应初步研究[J]. 中国农学通报， 2012， 28（25）： 191-195.