独活寄生汤通过miRNAs调控炎症性骨关节炎软骨细胞功能改变的机制探讨

陈后煌 邵翔 马玉环 郑文伟 叶蕻芝 李西海

【摘 要】 软骨细胞功能改变在骨关节炎病理过程中发挥重要的调控作用。炎症因子是介导骨关节炎软骨退变的主要因素，其表达与MicroRNAs （miRNAs）密切相关。miRNAs是一类在转录后水平调控基因表达的非编码蛋白的RNA分子，参与了软骨细胞增殖、分化，以及合成与分解代谢等生物学过程。中医药治疗骨关节炎独具特色，能够靶向调节miRNAs介导的炎症反应，独活寄生汤长期运用于临床，能有效抑制关节炎症，其药效机制可能是通过调节骨关节炎软骨细胞中miRNAs的表达，以及改变miRNAs和炎症因子之间的相互协调作用而发挥对炎症性骨关节炎的治疗作用。多层次、多角度地探讨独活寄生汤的作用机制及药效物质基础，可为阐明独活寄生汤治疗炎症性骨关节炎提供新的研究思路。

【关键词】 骨关节炎；独活寄生汤；软骨细胞；miRNAs；炎症

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.09.016

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是多种生物因素与机械损伤因素相互作用所致生物力学紊乱而引起的病理改变[1]，并以软骨退变为其根本病理变化。软骨细胞是软骨中的唯一细胞，分散于细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）中，对维持软骨的完整性以及软骨的负重功能具有重要作用。软骨细胞功能退变，是引起OA的重要因素。独活寄生汤能够有效改善OA软骨的炎性症状[2]，但其具体机制不甚明了。现就miRNAs与炎症性OA的关系及独活寄生汤调控炎症性OA的机制进行探讨。

1 miRNAs调控OA软骨细胞功能的机制

miRNAs是一类内源性、非编码蛋白的单链小RNA家族，由20～22个核苷酸组成，在转录后水平调节基因的表达，通过调节细胞的增殖、分化等影响细胞的功能[3]。目前研究发现，miRNAs表达广泛，在OA软骨细胞增殖、分化，以及合成与分解代谢等过程中发挥重要的调控作用[4]。

1.1 miRNA调控软骨细胞的增殖 miRNAs能够上调Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达，促进软骨基质的合成和软骨细胞的增殖。miR-200a特异性地在胚胎发育过程中表达，研究表明，miR-200a能够下调软骨中促软骨细胞形成基因的表达，而转染miR-200a抑制剂到发育中的下颌髁突软骨中，则促进了软骨的形成，提示miR-200a可能通过调控软骨细胞的增殖，抑制早期软骨形成[5]。将双链miR-21转染到软骨细胞后，促进了软骨细胞的增殖以及软骨基质的合成[6]。

1.2 miRNA调控软骨细胞的分化 组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）4特异性地在非肥大软骨细胞中表达，并且通过抑制转录因子Runx2的激活调控软骨细胞的肥大分化。研究证实，HDAC4是miR-140的下游靶标之一[7]，而miR-140在促进软骨细胞分化中的关键作用已被证实[8]。因此，miR-140可通过抑制HDAC4的表达，从而消除HDAC4对转录因子Runx2的抑制作用，进而促进软骨细胞的肥大分化。miR-145可直接作用于其靶标SOX-9，从而调控软骨细胞分化的早期阶段[9]。miR-145还可以特异性地降低OA软骨ECM中Col2a1基因、蛋白聚糖和miR-140的表达，同时上调软骨细胞中Runx2和基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinases-13，MMP-13）的表达水平[10]。此外，miR-221也被证实可以促进软骨细胞的分化和软骨ECM的合成[11]。

1.3 miRNA调控软骨细胞的凋亡 软骨细胞凋亡是引起OA的重要分子事件，众多miRNAs参与关节软骨细胞的凋亡过程。白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）诱导的OA模型中，关节软骨细胞凋亡的数量随着miR-34a水平的增加而增加，表明miR-34a可能与软骨细胞的过度凋亡有关，当使用miR-34a抑制剂或者沉默miR-34a后，软骨细胞凋亡的现象出现明显的改善[12]。IL-1β介导的OA模型中，miR-145呈高表达，miR-145通过调控Smad3继而影响后者下游基因的表达，最终导致OA软骨细胞ECM的降解[13]。与之相反的是，在相同OA模型中，miR-127-5p的表达量降低并伴随MMP-13的表达量上升。而过表达的miR-127-5p则可以抑制MMP-13的产生，并且减缓OA软骨退变进程[14]。miR-27a通过减少MMP-1和IGFBP5的合成，抑制软骨细胞凋亡，从而间接调控OA的病理进程[15]。

2 miRNAs调控炎症性OA的机制

2.1 炎症介质参与OA软骨细胞功能改变的机制 炎症介质对OA的發病进展具有重要影响，其中，细胞因子在OA发病中的作用越来越受关注，其在OA软骨细胞凋亡中发挥重要作用。IL-1和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是OA病理过程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏的最主要细胞因子，对维持关节软骨ECM的降解与合成平衡具有关键作用[16]。IL-1分为IL-1α和IL-1β两种亚型，它们生物活性相似，具有相同的致炎能力，其中IL-1β在整个OA进程中处于核心地位。

OA中存在明显的软骨细胞凋亡。参与炎症介导的软骨细胞凋亡信号通路有：一氧化氮（nitric oxide，NO）途径、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路和核转录因子-κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）通路等。NO是IL-1β作用于软骨细胞的主要效应分子，正常软骨细胞中无NO产生，IL-1β等可以激活诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide，iNOS）产生大量NO，后者可引起体外培养的软骨细胞发生凋亡[17]。IL-1通过激活NF-κB途径，影响细胞核内基因转录和转录后修饰，诱导软骨细胞合成MMPs、NO和蛋白聚糖酶等，最终引起关节炎症和软骨细胞凋亡[18]。另外，IL-1可直接引起线粒体功能异常、能量衰竭，进而诱导软骨细胞凋亡。TNF-α在OA软骨中表达上调，其通过激活MAPK信号下游的MEK/ERK信号通路，抑制促合成代谢因子SOX-9、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的产生，进而诱导软骨细胞凋亡[19]。

2.2 miRNAs参与调控炎症性OA的软骨细胞功能改变 miRNAs广泛参与OA的炎症反应过程，尤其是炎症因子介导的软骨细胞凋亡[20]。在OA软骨中，存在着某种由透明质酸、纤连蛋白、胶原或蛋白聚糖等分子揭示的内源性损伤相关分子模式，这些分子能被TOLL样受体（TLRs）以一种外源性病原相关分子模式识别[21-22]。TOLL样受体信号能够激活NF-κB信号，后者能够诱导相关基因的表达，继而诱发OA的炎症反应[23]。同样，促炎细胞因子IL-1能够激活NF-κB信号，因此IL-1可能通过调控基因的表达，在关节软骨的分解代谢中发挥重要作用。

众多miRNAs参与了对这些信号通路的调控。miR-155通过靶向调节TGF-β激活的蛋白激酶1结合蛋白2，抑制TGF-β激活的蛋白激酶1，继而抑制NF-κB和MAPK信号，从而负向调节TLR/IL-1介导的炎症性通路[24]。miR-146a则通过激活IL-1受体相关蛋白激酶1和TNF受体相关因子6，减少MMP-13、ADAMTS-5对Ⅱ型胶原和蛋白多糖的降解，抑制上述炎症性通路的激活[25-26]。IL-1β诱导产生的其他miRNAs包括miR-194和miR-27b等[27-28]。

3 独活寄生汤治疗炎症性OA的机制探讨

OA属中医学“痹证”范畴，其发病机制分为虚实两类，气血虚弱、肝肾亏虚，则筋骨失养，即不荣则痛，属虚证；风寒湿邪侵袭，则经络气血瘀阻，即不通则痛，属实证。OA核心病机为本痿标痹，病在筋骨，病位在肝肾。肝肾亏虚，筋骨失养而为痿；腠理空虚易感风寒湿之邪而为痹[29]。基于OA本痿标痹的病理特点，治以补肾柔肝为主（治痿），辅以祛风除湿散寒（治痹）。

3.1 独活寄生汤的立论依据 独活寄生汤出自唐·孙思邈的《备急千金要方》，方药由独活9 g，桑寄生、牛膝、肉桂、当归、干地黄、杜仲、芍药、细辛、川芎、秦艽、防风、人参、茯苓、甘草各

6 g组成。独活长于祛下焦风寒湿邪，蠲痹止痛，为君药。肉桂温里祛寒，通利血脉；秦艽、防风祛风胜湿；细辛祛寒止痛，均为臣药。川芎、干地黄、当归养血活血；桑寄生、杜仲、牛膝、芍药补肾柔肝，强壮筋骨；人参、茯苓、甘草补气健脾，扶助正气；以上各药均为佐药。甘草调和诸药，为使药。本方以祛风寒湿药为主，辅以补肝肾、养气血、行气活血、通络止痛之品，邪正兼顾。诸药相伍，使风寒湿邪俱除，气血充足，肝肾强健，痹痛得以缓解[30]。独活寄生汤具有扶正祛邪、标本兼顾的特点，体现中医学“以通为用”的治疗原则，故为临床治疗OA的经典名方之一[31]。

3.2 独活寄生汤治疗炎症性OA的药理基础 软骨退变是OA的主要病理特征，是多因素综合作用引起的软骨细胞、软骨下骨及软骨基质降解与合成偶联失衡的结果。炎症反应介导的软骨基质降解是引起OA 软骨退变的关键因素，也在OA的病理过程中发挥重要的调控作用。IL-1β、TNF-α等诱导炎症反应，促进软骨退变，在OA发病过程中发挥重要的调控作用。因此，抑制炎症因子对软骨的破坏，成为治疗OA的重要途径。

有学者对补肾活血法的研究显示，活血中药与补肾中药均能保护OA软骨细胞及维持软骨的完整性，延缓软骨内胶原的破坏及性质改变，抑制关节软骨炎症反应，进而对OA起治療作用。活血祛风、补肾柔肝类中药复方能通过影响OA关节软骨内的炎症因子、MMPs、自由基等，从而减轻关节软骨基质的退变与降解，进而起到保护关节软骨、防治OA的作用。另有研究表明，具有活血化瘀、泄浊除湿功效的泄浊除痹汤能够抑制细胞因子介导的炎症反应[32]。以上研究结果均为补肾活血、祛风除湿类复方治疗炎症性OA提供了药理学基础。

独活寄生汤以独活、秦艽、防风、肉桂、细辛祛风除湿散寒，而祛风除湿散寒药能抗炎、镇痛，通过调控细胞因子之间的相互作用，参与调控影响软骨细胞功能变化的信号转导通路，从而调节软骨基质降解与合成的平衡[33]；川芎、干地黄、人参、当归、茯苓、甘草活血补血，益气健脾，而益气活血药可以降低骨内压、改善骨内微循环，以及骨内血流动力学状态，并且可能通过提高SOD活性，抑制NO生成，阻止NO、自由基对软骨细胞的破坏，其中，NO通过介导炎性因子，促进软骨基质降解，诱导软骨的退变[34]；桑寄生、杜仲、牛膝、芍药补肾柔肝，强筋壮骨，补肾柔肝药能多层次地调节下丘脑-垂体-性腺轴功能及神经-内分泌-免疫网络系统，上调性激素水平，调节异常的细胞因子水平，抑制滑膜炎症，延缓软骨细胞的功能退变，调节软骨基质的降解，参与调控软骨退变[29，31]。现代药理研究表明，独活寄生汤具有以下作用：抗炎，镇痛；扩张血管，改善微循环；免疫调节；改善滑膜组织病理形态[35-36]。

研究表明，具有补气、活血、通络功效的补阳还五汤能够下调miR-221、miR-222的表达水平[37]。

活血化瘀、泄浊除湿的泄浊除痹汤能够调控多种miRNAs的表达，通过调控miR-146a的表达，抑制炎症反应[32]。补肾活血方可以下调miR-210的表达水平[38]。实验研究发现，独活寄生汤通过抑制IL-1、IL-6、TNF-α和MMP-13等的表达水平，减少炎症因子对关节软骨基质的降解，延缓关节软骨的退变[39-41]，而miRNAs与IL-1、IL-6和TNF-α等诱导的软骨细胞凋亡过程密切相关[42-43]。以上种种研究结果表明，具有补肾柔肝、祛风除湿散寒之功效的独活寄生汤在治疗炎症性OA时，可能同时伴有对miRNAs的调控过程。

4 结 语

综上所述，基于miRNAs与炎症因子在调控炎症性OA软骨细胞功能的过程中相互影响、相互作用，且研究已证实，独活寄生汤能够有效改善炎症性OA患者临床症状，有效抑制IL-1、IL-6和TNF-α等炎症因子引起的软骨退变，延缓OA的病理进程。我们有理由相信，独活寄生汤可能通过调节OA软骨细胞中miRNAs的表达，以及改变miRNAs和炎症因子之间的相互协调作用而发挥对炎症性OA的治疗作用。

5 參考文献

[1] 李西海，梁文娜，叶蕻芝，等.独活寄生汤调控风寒湿痹型骨关节炎软骨下骨重建失衡的作用机制探

讨[J].风湿病与关节炎，2014，3（8）：62-64.

[2] 郑进昌，徐东明，许凯洲.独活寄生汤治疗膝关节退行性关节炎的临床研究[J].中国医药导报，2013，10（3）：123-124.

[3] Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[4] Le LT，Swingler TE，Clark IM.Review：the role of microRNAs in osteoarthritis and chondrogenesis[J].Arthritis Rheum，2013，65（8）：1963-1974.

[5] Umeda M，Terao F，Miyazaki K，et al.MicroRNA-200a Regulates the Development of Mandibular Condylar Cartilage[J].J Dent Res，2015，94（6）：795-802.

[6] Kongcharoensombat W，Nakasa T，Ishikawa M，et al.The effect of microRNA-21 on proliferation and matrix synthesis of chondrocytes embedded in atelocollagen

gel[J].Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2010，18（12）：1679-1684.

[7] Miyaki S，Sato T，Inoue A，et al.MicroRNA-140 plays dual roles in both cartilage development and homeostasis[J].Genes Dev，2010，24（11）：1173-1185.

[8] Miyaki S，Nakasa T，Otsuki S，et al.MicroRNA-140 is expressed in differentiated human articular chondrocytes and modulates interleukin-1 responses[J].Arthritis Rheum，2009，60（9）：2723-2730.

[9] Yang B，Guo H，Zhang Y，et al.MicroRNA-145 regulates chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells by targeting Sox9[J].PLoS One，2011，6（7）：e21679.

[10] Martinez-Sanchez A，Dudek KA，Murphy CL.Regulation of human chondrocyte function through direct inhibition of cartilage master regulator SOX9 by microRNA-145 （miRNA-145）[J].J Biol Chem，2012，287（2）：916-924.

[11] Kim D，Song J，Jin EJ.MicroRNA-221 regulates chondrogenic differentiation through promoting proteosomal degradation of slug by targeting Mdm2[J].J Biol Chem，2010，285（35）：26900-26907.

[12] Abouheif MM，Nakasa T，Shibuya H，et al.Silencing microRNA-34a inhibits chondrocyte apoptosis in a rat osteoarthritis model in vitro[J].Rheumatology（Oxford），2010，49（11）：2054-2060.

[13] Yang B，Kang X，Xing Y，et al.Effect of microRNA-145 on IL-1beta-induced cartilage degradation in human chondrocytes[J].FEBS Lett，2014，588（14）：2344-2352.

[14] Park SJ，Cheon EJ，Lee MH，et al.MicroRNA-127-5p regulates matrix metalloproteinase 13 expression and interleukin-1β-induced catabolic effects in human chondrocytes[J].Arthritis Rheum，2013，65（12）：3141-3152.

[15] Akhtar N，Rasheed Z，Ramamurthy S，et al.MicroRNA-27b regulates the expression of matrix metalloproteinase 13 in human osteoarthritis chondrocytes[J].Arthritis Rheum，2010，62（5）：1361-1371.

[16] Blom AB，van der Kraan PM，van den Berg WB.Cytokine targeting in osteoarthritis[J].Curr Drug Targets，2007，8（2）：283-292.

[17] 邵越峰，陈维毅，卫小春，等.周期性张应变对重组人白细胞介素-1β诱导的一氧化氮表达作用的实验研究[J].中国药物与临床，2009，9（4）：265-267.

[18] Berenbaum F.Signaling transduction：target in osteoarthritis[J].Curr Opin Rheumatol，2004，16（5）：616-622.

[19] Appleton CT，Usmani SE，Mort JS，et al.Rho/ROCK and MEK/ERK activation by transforming growth factor-alpha induces articular cartilage degradation[J].Lab Invest，2010，90（1）：20-30.

[20] Iliopoulos D，Malizos KN，Oikonomou P，et al.Integrative microRNA and proteomic approaches identify novel osteoarthritis genes and their collaborative metabolic and inflammatory networks[J].PLoS One，2008，3（11）：e3740.

[21] Sofat N.Analysing the role of endogenous matrix molecules in the development of osteoarthritis[J].Int J Exp Pathol，2009，90（5）：463-479.

[22] Piccinini AM，Midwood KS.DAMPening inflammation by modulating TLR signalling[J].Mediators Inflamm，2010：672395.

[23] Marcu KB，Otero M，Olivotto E，et al.NF-κappaB signaling：multiple angles to target OA[J].Curr Drug Targets，2010，11（5）：599-613.

[24] Ceppi M，Pereira PM，Dunand-Sauthier I，et al.MicroRNA-

155 modulates the interleukin-1 signaling pathway in

activated human monocyte-derived dendritic cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（8）：2735-2740.

[25] Taganov KD，Boldin MP，Chang KJ，et al.NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146，an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（33）：12481-12486.

[26] Gu SX，Li X，Hamilton JL，et al.MicroRNA-146a reduces IL-1 dependent inflammatory responses in the intervertebral disc[J].Gene，2015，555（2）：80-87.

[27] Xu J，Kang Y，Liao WM，et al.MiR-194 regulates chondrogenic differentiation of human adipose-derived stem cells by targeting Sox5[J].PLoS One，2012，7（3）：e31861.

[28] Akhtar N，Rasheed Z，Ramamurthy S，et al.MicroRNA-κ27b regulates the expression of matrix metalloproteinase 13 in human osteoarthritis chondrocytes[J].Arthritis Rheum，2010，62（5）：1361-1371.

[29] 李西海，陳文列，刘献祥.补肾柔肝法防治骨性关节炎作用机制探讨[J].福建中医药大学学报，2011，21（2）：66-69.

[30] 吴广文，褚剑锋，许惠凤，等.独活寄生汤的药理作用及其在治疗骨性关节炎中的应用[J].中医正骨，2012，24（1）：37-39.

[31] 李西海，张翼，叶蕻芝，等.独活寄生汤治疗风寒湿痹型膝骨关节炎的机制[J].中医正骨，2012，24（1）：68-71.

[32] Sun WF，Zhang XX，Sun FY，et al.MicroRNA expression patterns of the kidney in hyperuricemia mice treated with Xiezhuo Chubi Decoction[J].Chin J Integr Med，2011，17（1）：35-42.

[33] 鄭春松，徐筱杰，刘献祥，等.精制透骨消痛颗粒防治骨性关节炎的计算机药理学[J].物理化学学报，2010，26（3）：775-783.

[34] 邵敏.补肾活血中药对体外培养软骨细胞SOD、NOS的影响[J].福建中医药，2006，37（4）：48-49.

[35] 陈成然.独活寄生汤现代药理研究及临床应用[J].现代中西医结合杂志，2004，13（21）：2926-2928.

[36] 王爱武，刘娅，雒琪，等.独活寄生汤抗炎、镇痛作用的药效学研究[J].中国实验方剂学杂志，2008，14（12）：61-64.

[37] Yang J，Gao F，Zhang Y，et al.Buyang Huanwu Decoction （BYHWD）Enhances Angiogenic Effect of Mesenchymal Stem Cell by Upregulating VEGF Expression After Focal Cerebral Ischemia[J].J Mol Neurosci，2015，56（4）：898-906.

[38] 张倍源.补肾活血方调控microRNA-210促进BMSCs成骨分化的研究[J].中国骨质疏松杂志，2014，

20（4）：396-399.

[39] 郑春松，叶蕻芝，许惠凤，等.分子对接法预测独活寄生汤对TNF-α和IL-1β作用的活性成分[J].福建中医药大学学报，2012，22（4）：28-30.

[40] 高骏.独活寄生汤对膝骨性关节炎患者血清肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6水平的影响[J].新中医，2015，47（2）：106-107.

[41] Wu G，Fan H，Huang Y，et al.Duhuo Jisheng Decoctioncontaining serum promotes proliferation of interleukin1βinduced chondrocytes through the p16-cyclin D1/CDK4-Rb pathway[J].Mol Med Rep，2014，10（5）：2525-2534.

[42] Gu SX，Li X，Hamilton JL，et al.MicroRNA-146a reduces IL-1 dependent inflammatory responses in the intervertebral disc[J].Gene，2015，555（2）：80-87.

[43] Santini P，Politi L，Vedova PD，et al.The inflammatory circuitry of miR-149 as a pathological mechanism in osteoarthritis[J].Rheumatol Int，2014，34（5）：711-716.

收稿日期：2015-05-31；修回日期：2015-07-30