兔骨关节炎模型中Wnt/β—catenin信号通路研究

刘洪彦 郑毅

【摘 要】目的：探讨兔骨关节炎软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路的表达情况及其在骨关节炎中的作用。方法：采用改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型，分阶段酶消化法分离正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞。采用ELISA法检测正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞中β连环蛋白（β-catenin）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶-4（ADAMTS-4）、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、白细胞介素（IL）-1β、IL-18和IL-33的水平。結果：与正常对照组比较，骨关节炎组β-catenin、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4的蛋白水平均明显升高，

Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的蛋白水平均明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。与正常对照组比较，骨关节炎组IL-1β、IL-18和IL-33蛋白水平差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：兔骨关节炎中Wnt/β-catenin信号通路明显激活，介导软骨细胞外基质分解代谢、促进软骨破坏，而炎性因子IL-1β、IL-18和IL-33可能在此过程中并未起到关键作用。

【关键词】 骨关节炎；Wnt/β-catenin信号通路；基质代谢；基质金属蛋白酶；白细胞介素；兔

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.09.001

A Study on Wnt/β-catenin Signal Pathway in Rabbit Models with Osteoarthritis

LIU Hong-yan，ZHENG Yi

【ABSTRACT】Objective：To investigate the expression of Wnt/ β-catenin pathway and its role in rabbits with osteoarthritis.Methods：Rabbit models with osteoarthritis were established with Modified Extension-fixation Method，and normal and osteoarthritis chondrocytes were isolated by enzyme digestion.ELISA method was used to detect the levels of β-catenin，MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4，type II collagen，proteoglycan，IL-1β，IL-18 and IL-33

in normal and osteoarthritis chondrocytes.Results：Compared with the normal control group，the protein levels of β-catenin，MMP-3，MMP-13 and ADAMTS-4 in the osteoarthritis were significantly increased，while the protein levels of type II collagen and proteoglycan were significantly decreased，the difference being statistically significant （P < 0.05）.Compared with the normal control group，the differences of the protein levels of IL-1β，IL-18 and IL-33 had no significant difference （P > 0.05）.Conclusion：The Wnt/β-catenin signal pathway in rabbits with osteoarthritis has been activated，which can mediate cartilage matrix and promote cartilage destruction，while the inflammatory factor IL-1β，IL-18 and IL-33 may not play a key role in the process.

【Keywords】osteoarthritis；Wnt/β-catenin signal pathway；matrix metabolism；matrix metalloproteinases；interleukin；rabbit

骨关节炎（osteoarthritis，OA）作为最常见的骨关节疾病，是导致中老年人慢性肌肉骨骼疼痛和活动障碍的最主要原因，但其发病机制仍不清楚。通过基因敲除的OA动物模型证实，主要由滑膜细胞分泌的促炎细胞因子如前列腺素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1、IL-6、一氧化氮（NO）等在OA的病理过程中并未起到关键作用[1]。而一些动物实验研究则表明，基质金属蛋白酶（MMPs）、聚蛋白多糖酶（aggrecanases）等蛋白酶对关节软骨主要基质成分Ⅱ型胶原以及蛋白多糖的降解，是导致OA 产生的主要原因[2]。但是，这些蛋白酶的特异抑制剂在治疗OA过程中的疗效却并不尽如人意，且具有较为严重的不良反应[3]。

因此，对软骨细胞中这些蛋白酶的上游信号通路——Wnt 信号通路的研究，已成为新的热点。

1 实验材料

1.1 实验动物 6月龄健康普通级新西兰大耳兔16只，雄性，体质量2～2.5 kg，复合饲料喂养，北京房山动物养殖厂提供，动物合格证号SYZK（京）2012-0016。

1.2 实验试剂 DMEM-F12细胞培养液（美国Hyclone公司）；胎牛血清（哈尔滨元亨生物药业有限公司）；兔β-catenin、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、IL-1β、IL-18、

IL-33 ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公

司）；抗Ⅱ型胶原抗体（北京博奥森生物有限

公司）。

2 方 法

2.1 造模及模型鉴定 适应性喂养1周后，随机分为OA组和正常对照组，每组8只。正常对照组不做处理。OA组参照文献[4]方法并进行改良造模，具体方法如下：将兔毛剪短至0.5 cm左右，左后肢膝关节完全屈曲，用管型石膏将其固定于过屈位，长度从髋关节远端约2 cm至踝关节上缘

2 cm，石膏干硬前在石膏外面缠以细铁丝，待石膏干硬后放回兔笼。造模过程中观察家兔一般状态、双腿的活动情况、造模肢体改变等。若发现有肢端明显肿胀、张力性水泡或溃烂感染及石膏松脱、咬损严重等现象，则立即卸掉重打。造模7周后通过膝关节X线摄影进行影像学成模鉴定。同时处死家兔，无菌条件下取造模膝关节软骨组织，制作石蜡标本进行甲苯胺蓝染色，进行病理学成模鉴定。

2.2 软骨细胞分离培养及鉴定 正常对照组和OA组家兔处死后，无菌条件下分别取膝关节软骨细胞，采用分阶段酶消化法分离软骨细胞，用质量分数为20%FBS的DMEM-F12，37 ℃，体积分数为5%的CO2进行原代培養及传代培养。取二代软骨细胞进行爬片，行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定软骨细胞。

2.3 蛋白水平检测 取二代正常软骨细胞和OA软骨细胞进行培养，48 h后取细胞上清液进行ELISA法检测Wnt/β-catenin信号通路相关因子（β-catenin、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4）、软骨基质成分（Ⅱ型胶原、蛋白聚糖），以及炎性介质（IL-1β、IL-18、IL-33）等蛋白水平。具体方法参照ELISA试剂盒要求。

2.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用t检验。以

P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 模型鉴定

3.1.1 影像学鉴定 正常对照组关节表面光滑，无骨赘形成，关节间隙正常。OA组可见表面模糊，有骨赘形成，关节间隙狭窄。见图1。

（1）正常对照组 （2）OA组

图1 正常对照组及OA组膝关节影像学特点

3.1.2 病理学鉴定 正常对照组膝关节软骨切片显示关节面平整，潮线完好，细胞形态正常、排列整齐，基质均匀。OA组可见潮线消失、软骨细胞聚集、变形、基质失染等。见图2。

（1）正常对照组 （2）OA组

图2 兔膝关节软骨病理学特点（甲苯胺蓝染色×200）

3.2 软骨细胞鉴定

3.2.1 甲苯胺蓝染色 软骨细胞经甲苯胺蓝染色后，细胞质染成浅蓝色，细胞核染成深蓝色，可见1～2个核仁。见图3。

图3 软骨细胞甲苯胺蓝染色（×200）

3.2.2 Ⅱ型胶原免疫组化染色 软骨细胞的胞浆内出现黄染颗粒或被染成棕黄色，胞核不着色，细胞外区域也可见到棕色。见图4。

图4 软骨细胞II型胶原免疫组化染色（×100）

3.3 两组软骨细胞培养上清液中Wnt/β-catenin信号通路相关因子蛋白检测比较 与正常对照组比较，OA组细胞培养上清液中β-catenin、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4的蛋白水平均明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的蛋白水平均明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

3.4 两组软骨细胞培养上清液中IL-33、IL-18和IL-1β水平检测比较 与正常对照组比较，OA组细胞培养上清液中IL-1β和IL-18、IL-33蛋白水平差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

4 讨 论

Wnt信号转导途径作为一个庞大而复杂的信号转导系统，与骨骼发育有关，还与骨组织细胞分化、生长、凋亡、死亡、骨量调节等多个病理生理过程有关。近年研究发现，Wnt信号通路的异常使骨骼系统代谢失衡，可导致OA的发生[4]。Wnt信号途径有3条胞内转导途径，分别是Wnt/β-catenin通路、Wnt/Ca2+通路、Wnt/PCP通路。Wnt/β-catenin信号通路是最经典且研究较多的信号通路。

目前认为，Wnt/β-catenin信号通路主要途径如下：Wnt蛋白结合受体复合物，受体复合物包括低密度脂蛋白受体相关蛋白和Frizzled蛋白。它们结合后通过G蛋白偶联受体信号转导方式将信号导入胞内，抑制糖原合成酶-3β。在没有Wnt信号的情况下，糖原合成酶-3β磷酸化β-catenin降解。β-catenin表达主要位于细胞膜，胞浆内很少。存在Wnt信号时，β-catenin在细胞浆中积累，累积到一定量即进入核内与Lef/Tcf结合激活靶基因转录。且认为，Wnt/β-catenin信号通路的靶基因包括参与细胞增殖、凋亡、炎症和基质代谢的基因，其中包括MMPs（如MMP-3、MMP-13）和aggrecanases（如ADAMTS-4）等。

OA被公认为是机械性和生物性因素作用的结果，破坏了关节软骨、细胞外基质和软骨下骨正常合成和降解偶联的结果。关节软骨退变的一个重要表现是细胞外基质（包括II型胶原和蛋白聚糖）代谢功能障碍。Ⅱ型胶原的代谢平衡是通过MMPs和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）的调节来实现的，而蛋白聚糖主要依靠aggrecanases来实现，

aggrecanases屬于ADAMTS家族。MMPs能够降解软骨基质的所有成分，MMP-1、MMP-2、MMP-3、

MMP-7、MMP-9、MMP-13均发挥此作用；研究发现，MMP-1、MMP-8、MMP-13能够高效降解胶原纤维Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中MMP-13是促进基质降解的关键酶，由于其对Ⅱ型胶原有优先消化作用，而ADAMTS-4和ADAMTS-5可促进蛋白聚糖的分解代谢。

研究发现，Wnt/β-catenin信号通路可通过调控MMPs发挥对软骨基质的作用。Zhu等[5]发现，β-catenin的激活可导致MMPs的明显增加，引起软骨细胞外基质降解、软骨破坏。Shortkroff等[6]在体外培养软骨细胞并激活其中Wnt/β-catenin信号通路的表达，发现氨基葡聚糖含量显著降低，仅为对照组的16%，细胞外基质合成明显减少。Yuasa等[7]用Wnt3A培养或转入表达β-catenin可活化软骨细胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4/-5蛋白酶的基因表达，引起细胞外基质的降解。

本实验研究发现，OA软骨中β-catenin表达明显增加，Wnt/β-catenin信号通路激活，同时MMP-3、

MMP-13及ADAMTS-4表达明显升高，而Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达下降。这提示兔OA中Wnt/β-catenin信号通路激活，而Wnt/β-catenin信号通路可通过调控MMPs和ADAMTS发挥对软骨基质的作用。这与目前国内外研究是一致的。Ryu等[8]发现，在OA退变的软骨细胞中β-catenin大量聚集，软骨细胞正常形态丢失并且异常分化。Fang等[9]

在人软骨组织中也发现了β-catenin的高表达。笔者收集了40例行全膝关节置换术的OA患者和10例

股骨髁骨折和截肢患者的关节软骨，结果发现，正常关节软骨中β-catenin很少表达，但在退变软骨中则大量表达，而且中度到重度的退变软骨高于轻度退变的软骨。

OA的炎症介质（如IL、PG、TNF-α、NO等）在OA发病中也发挥了重要作用。IL-1可促进多种炎性因子的分泌，也是软骨基质降解的主要驱动因子，可促进软骨降解酶类的合成与分泌，导致软骨的损伤。IL-18、IL-33具有和IL-1相似的促炎反应。而本实验以兔膝OA软骨细胞进行实验，结果显示，IL-1β、IL-18和IL-33在OA中水平较正常软骨细胞升高，但差异无统计学意义（P > 0.05），而同时MMPs和ADAMTs水平明显升高，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖水平明显下降。这提示在IL-1、IL-18、IL-33等炎性因子无明显升高时，仍有明显的软骨基质破坏，表明上述炎性因子在软骨破坏过程中并未起到关键作用，这与国外研究一致。Clements等[1]对OA小鼠模型的IL-1β基因进行敲除，结果发现，与野生型小鼠相比，基因敲除小鼠出现快速进展的软骨破坏，表现为MMPs和ADAMTs的显著增加，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的明显降低，提示在无IL-1β的作用下，OA软骨基质仍有明显破坏，IL-1β并未在OA软骨破坏中发挥关键作用。

综上所述，兔OA中Wnt/β-catenin信号通路明显激活，介导软骨细胞外基质代谢，导致软骨的破坏；而炎性因子IL-1、IL-18、IL-33在软骨破坏过程中并未起到关键作用。

5 参考文献

[1] Clements KM，Price JS，Chambers MG，et al.Gene deletion of either interleukin-1beta，interleukin-1beta-converting enzyme，inducible nitric oxide synthase，or stromelysin 1 accelerates the development of knee osteoarthritis in mice after surgical transection of the medial collateral ligament and partial medial meniscectomy[J].Arthritis Rheum，2003，48（12）：3452-3463.

[2] Little CB，Meeker CT，Golub SB，et al.Blocking aggrecanase cleavage in the aggrecan interglobular domain abrogates cartilage erosion and promotes cartilage

repair[J].J Clin Invest，2007，117（6）：1627-1636.

[3] Burrage PS，Brinckerhoff CE.Molecular targets in osteoarthritis：metalloproteinases and their inhibitors[J].Curr Drug Targets，2007，8（2）：293-303.

[4] Wu Q，Zhu M，Rosier RN，et al.Bate-catenin，cartilage，

and osteoarthritis[J].Ann N Y Acad Sci，2010，1192（1）：344-350.

[5] Zhu M，Tang D，Wu Q，et al.Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice[J].J Bone Miner Res，2009，24（1）：12-21.

[6] Shortkroff S，Yates KE.Alteration of matrix glycosaminoglycans diminishes articular chrondrocytes' response to a canonical Wnt signal[J].Osteoarthritis Cartilage，2007，15（2）：147-154.

[7] Yuasa T，Otani T，Koike T，et al.Wnt/beta-catenin signaling stimulates matrix catabolic genes and activity in articular chondrocytes：its possible role in joint degeneration[J].Lab Invest，2008，88（3）：264-274.

[8] Ryu JH，Kim SJ，Kim SH，et al.Regulation of the chondrocyte phenotype by beta-catenin[J].Development，2002，129（23）：5541-5550.

[9] Fang X，Shi X，Gao Z，et al.Expression of beta-catenin in articular cartilage of knee primary osteoarthritis[J].Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi，2012，26（5）：532-535.

收稿日期：2015-06-11；修回日期：2015-07-04