黄连素对阿尔茨海默病模型大鼠的保护作用

孙 钿

(三峡大学仁和医院神经内科，湖北 宜昌 443000)

黄连素(BC)是乙酰胆碱酯酶抑制剂。以往报道表明BC能够调节β样淀粉蛋白生产过程中的β分泌酶的活性，但是BC在阿尔茨海默病(AD)模型中的具体作用机制尚不明确〔1～4〕。本实验探讨BC在同型半胱氨酸(Hcy)诱导的AD模型的作用。

1 材料和方法

1.1 动物及分组 雄性SD大鼠3～4月龄，(280±20)g购买自武汉大学动物实验中心。SD大鼠随机地分为空白对照组、模型组和治疗组，每组11只。模型组大鼠尾静脉注射 Hcy(400 μg·kg－1·d－1)，治疗组同时灌胃给予黄连素(50 mg·kg－1·d－1)。空白对照组给予生理盐水，连续造模14 d。

1.2 试剂 Hcy和黄连素购自美国Sigma公司。过氧化氢酶(CAT)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒购自美国R＆D公司。Western印迹抗体购自美国Protein Tech公司。

1.3 Morris水迷宫 Morris水迷宫被用来检测SD大鼠的空间学习、记忆能力。水迷宫由一个内壁直径为150 cm的黑色的圆形水池组成，划分成4个象限，在第3象限(目标象限)放置有一个直径为30 cm的透明的平台，该平台位于水面下1厘米，迷宫及平台位置保持不变。在每次实验中，大鼠从1、2、4象限中点放入水池，训练大鼠找到平台，记录大鼠找到平台的时间(潜伏期)，如果大鼠在60 s内没有找到平台，则引导大鼠到平台上并在平台上停留20 s。通过一个摄像头，和连接着的数字跟踪设备采集大鼠的潜伏期和运动轨迹。训练6 d，第7天撤掉平台，检测大鼠到达平台位置的时间及穿越平台所在位置的次数。

1.4 CAT、GSH-Px活性检测 大鼠经麻醉处死后，迅速称取海马组织，使用电动匀浆器将海马组织放在生理盐水中研磨成10%的组织匀浆液，经过3 000 r/min离心10 min，取上清液体，生理盐水稀释成1%的匀浆液，按试剂盒说明书进行操作。CAT活性在405 nm处检测吸光度值，GSH-Px活性在412 nm处检测吸光度值。

1.5 免疫印迹 10%SDS-PAGE胶电泳，通过湿式转移法将PAGE胶中的蛋白转至PVDF膜上，用封闭液(碧云天公司)封闭1 h，特异性一抗4℃孵育过夜，T-TBS漂洗3次后，使用HRP标记的二抗继续孵育1 h，采用ECL显色，并分析灰度值。

1.6 统计学方法 采用SPSS12.0软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 黄连素对AD大鼠空间学习及记忆能力的影响 随训练时间的推移，各组大鼠的潜伏期都逐渐缩短，学习、记忆能力逐渐增强。模型组和空白对照组比较，其潜伏期显著变长(P＜0.05);和模型组比较，治疗组的潜伏期明显缩短(P＜0.05)，见表 1、表 2。

2.2 BC对AD大鼠CAT、GSH-Px活性的影响 见表3。与空白对照组比较，模型组大鼠海马组织中CAT、GSH-Px的活性均显著下降(P＜0.05)。经BC处理后，治疗组大鼠的海马组织中CAT、GSH-Px的活性均明显提高，(P＜0.05)。

2.3 BC对AD大鼠神经亡凋亡的影响 Hcy能够诱导SD大鼠海马发生凋亡，模型组caspase显著激活，而抗凋亡分子bcl-2表达则明显下降(P＜0.05)，见图1。相对灰度值比较见表4。

表1 各组SD大鼠学习期间的潜伏期比较(x±s，n=11，s)

表2 各组SD大鼠记忆检测结果比较(x±s，n=11)

表3 各组SD大鼠海马组织的CAT、GSH-Px活性(x±s，n=4)

图1 各组凋亡相关蛋白表达变化

表4 各组凋亡相关蛋白相对灰度值(x±s，n=4)

3 讨论

血浆中高Hcy已经被认为是AD的一个危险因素〔5〕。高Hcy血症的模型小鼠表现出许多AD样的病理变化，例如认知功能障碍，血脑屏障完整性的破坏，谷氨酸毒性，氧自由基紊乱，tau蛋白过度磷酸化以及β淀粉样蛋白沉积〔6〕。通过尾静脉注射Hcy已经被广泛应用作AD的动物模型，用来研究AD的发病机制〔7〕。BC，又称为小檗碱，是毛茛科植物根茎中的一种异喹啉类生物碱。BC有着广泛的药理作用，在心脑血管系统中黄连素具有抗心律失常，抗心力衰竭，抗高血压，保护脑血管的作用。血液系统中，BC具有抗血小板聚集，降血脂，降血糖，改善胰岛素抵抗，抗氧化应激，抗肿瘤等多种作用〔8～10〕。神经系统中，BC能够调节β分泌酶的活性，该酶在β样淀粉蛋白生产过程中起重要作用。本研究结果表明BC还可以改善模型大鼠抗氧化应激能力，提高模型大鼠抗凋亡能力。

综上，本研究表明BC可以改善AD模型大鼠的空间学习、记忆能力，其作用机制可能是通过提高AD模型大鼠的抗氧化应激能力和抗凋亡能力来实现的。

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