两色金鸡菊醇提物对2型糖尿病小鼠肠道菌群的影响

张凯楠，龙梅，冉新建，阳迎，仝磊，李清晨，熊健会，毛新民，陶亮，李琳琳*

（新疆医科大学1.临床医学院；2.基础医学院机能中心实验室；3.药理学教研室；4.中医学院，乌鲁木齐 830054)

研究报告

两色金鸡菊醇提物对2型糖尿病小鼠肠道菌群的影响

张凯楠1，龙梅2，冉新建2，阳迎1，仝磊1，李清晨1，熊健会3，毛新民4，陶亮3，李琳琳3*

（新疆医科大学1.临床医学院；2.基础医学院机能中心实验室；3.药理学教研室；4.中医学院，乌鲁木齐 830054)

目的探讨两色金鸡菊醇提物，肠道菌群和2型糖尿病（T2DM)之间的可能联系。方法收集模型组（A)，两色金鸡菊醇提物高剂量组1.8 g/kg（B)，两色金鸡菊醇提物中剂量组1.2 g/kg（C)，二甲双胍对照组0.2 g/kg（D)，空白对照组（E)粪便样本，采用16S rDNA实时荧光定量PCR技术检测粪便样本中球形梭菌与多形拟杆菌的水平；运用Pearson分析方法，对目标菌属水平与各组小鼠的空腹血糖（FBG)做相关性分析。结果①与正常组比较，模型组中球形梭菌与多形拟杆菌水平均增高（P=0.017，P=0.002)。②两色金鸡菊醇提物高剂量组与模型组相比，球形梭菌与多形拟杆菌的水平下降，且有统计学差异（2周:P=0.027，P=0.006；4周:P=0.007，P=0.012)。③球形梭菌水平、多形拟杆菌水平均与FBG水平呈正相关。结论两色金鸡菊醇提物对2型糖尿病小鼠肠道菌群存在着一定的影响且与其血糖水平存在相关性。

球形梭菌；多形拟杆菌；2型糖尿病；荧光定量PCR

据2013年9月《美国医学会杂志》报道的调查结果显示，我国18岁及以上成年人糖尿病患者达1.14亿人，患病率高达11.6%[1］，其中2型糖尿病（T2DM)占90%以上。T2DM是多种因素联合作用而导致的胰岛素抵抗[2］。近期有研究表明，肠道菌群很可能与肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病的发生发展有密切联系[3-5］。

人的肠道定植着复杂多样而又相对稳定的菌群，其对正常代谢起着较为重要的作用。球形梭菌是人类粪便中数量较多的菌群之一，参与构成宿主微生态系统，发挥维持微生态平衡、调节免疫等多方面的生理作用[7］。多形拟杆菌能降解不被人体消化和吸收的植物多糖（如纤维素等)。人体肠道几乎不含多糖消化酶，但多形拟杆菌却能解多糖，为宿主提供额外的能量，从而升高血糖。与此同时给予2型糖尿病大鼠补充益生菌，其胰岛β细胞得到保护，血糖、血浆总胆固醇显著降低[6］。这些研究均提示了肠道菌群与肥胖、2型糖尿病发生密切相关。

两色金鸡菊又名昆仑雪菊，是新疆地方特色药物之一，具有清热解毒、活血化瘀之效，可治疗燥热烦渴、高血压、心慌、胃肠不适等症状[8-9］。黄元等[10］研究发现，某些高寒菊科植物提取物能显著抑制a-葡萄糖苷酶活性。α-葡萄糖苷酶是一种在机体的代谢过程中起着关键作用的酶，它能使复合碳水化合物分解成可被人体吸收的单糖[11-12］。α-葡萄糖苷酶抑制剂能通过抑制该酶的活性，延缓糖类的吸收，可有效降低餐后血糖浓度峰值，提高糖耐量，预防并改善糖尿病及其并发症的发生和发展[13］。骆新[14］在昆仑雪菊对2型糖尿病大鼠的研究中显示:能有效的降低2型糖尿病大鼠的血糖，血脂水平。根据以上的研究，发现两色金鸡菊对降低血糖有一定的功效。

故本实验拟通过各组小鼠粪便中球形梭菌与多形拟杆菌的水平，分析球形梭菌与多形拟杆菌与2型糖尿病的相关性，初步判断两色金鸡菊醇提物对小鼠肠道菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级ICR雄性小鼠70只，购自新疆医科大学动物实验中心【SCXK（新)2011-0003】，周龄5周，体重22 g左右，饲养于新疆医科大学动物实验中心【SYXK（新)2011-0001】。昼夜明暗交替时间12 h/12 h，温度（21±2)℃，湿度45% ～55%，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 仪器与试剂

两色金鸡菊醇提物（专利申请中，申请号: 20120270752.0)；实时荧光定量仪（美国 Bio-Rad IQ5，)；凝胶成像仪（AIphaImager HP)；微量分光光度计（美国Thermo ND-2000)；天根粪便基因组提取试剂盒（中国天根生化科技有限公司)No:DP328-02)；SYBR Green PCR kit（德国Qiagen公司)；所用引物均参照文献，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，多形拟杆菌[21］（F:TCGAAAGTGTGGGTATCAAACA，R:CTGTATATCGCAAACAGCGAGT，Tm=55.0℃)；球形梭菌[15］（F:AATGACGGTACCTGACTAA，R:CTTTGAGTTTCATTCTTGCGAA，Tm= 50.0℃)

1.3 方法

1.3.1 四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的建立

SPF级ICR小鼠，雄性，体重22 g左右，高糖高脂饮食（葡萄糖20%，猪油10%，胆固醇2.5%，胆酸钠0.5%)喂养4周，禁食8～10 h后，腹腔注射四氧嘧啶溶液（美国 Sigma CAS:2244-11-3)180 mg/kg造模，72 h后，禁食8～12 h测小鼠空腹血糖。以空腹血糖≥11.1 mmol/L为造模成功。

1.3.2 小鼠的分组

选取成模小鼠40只，依照血糖体重水平随机分成4组，依次为模型组（A)，两色金鸡菊醇提物高剂量组1.8 g/kg（B)，两色金鸡菊醇提物中剂量组1.2 g/kg（C)，二甲双胍（中美上海施贵宝制药有限公司国药准字H20023370)对照组0.2 g/kg（D)，通过次对照组对比两色金鸡菊醇提物与目前临床一线用药的效能。再选取10只正常小鼠作为空白对照组（E)。

1.3.3 粪便的收集粪样肠道微生物总DNA提取

粪便样品细菌总DNA的提取按照天根粪便基因组提取试剂盒（中国天根生化科技有限公司)的使用说明进行操作。用微量分光光度计检测DNA浓度与纯度。

1.3.4 实时荧光定量PCR检测目标菌群水平。

1.3.5 标准品的配制

分别以球形梭菌与多形拟杆菌16S rDNA可变区引物进行PCR扩增，分别将球形梭菌与多形拟杆菌的PCR扩增目标片段切胶、回收后作为DNA标准品，具体操作步骤按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技有限公司)说明进行。

1.3.6 目标菌群水平的检测

将标准品稀释后浓度梯度为101～108copies/ μL的DNA样本为模板，同时以去核酸水作为阴性对照，进行荧光定量PCR。每个样本平行重复2次，反应体系及程序如下:

（1)反应体系（20μL):上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；荧光染料SYBR Green I 10μL；模板2.0μL；免酶水补水至20μL。

（2)反应程序:①预变性:95℃ 10 min，1个循环；②PCR反应95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。

1.3.7 统计分析

文中所有数据均采用SPSS 18.0统计软件进行数据整理和统计，数据以（±s)表示。计量资料运用单因素方差分析进行各组间比较，以Pearson相关系数评价变量间相关性，得出r值。P＜0.05，P＜0.01差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DNA的纯度检测

采用微量分光光度计测定细菌总DNA浓度，A260/A280的比值均在1.6～1.8，说明样品DNA的纯度较好，无蛋白质污染。

2.2 球形梭菌与多形拟杆菌在五组粪样中16S rDNA实时荧光定量PCR结果

与正常组比较，模型组中球形梭菌水平、多形拟杆菌水平均增高；两色金鸡菊醇提物高剂量组与模型组相比，球形梭菌与多形拟杆菌的水平下降，且有统计学差异。见表1，2。见图1，2。

2.3 相关性分析

分别将球形梭菌、多形拟杆菌水平与FBG水平进行Pearson相关性分析，球形梭菌、多形拟杆菌水平均与FBG水平呈正相关，见图3。

表1 五组样本中球形梭菌起始模板量对数值比较（±s，n=10)Tab.1 Numeric comparisons of Clostridium Coccoides starting template in the samples of five groups

表1 五组样本中球形梭菌起始模板量对数值比较（±s，n=10)Tab.1 Numeric comparisons of Clostridium Coccoides starting template in the samples of five groups

注:#:与空白对照组比较；*:与模型组比较；&:与二甲双胍对照组比较。Note.#.Compared with the blank group.*.Compared with themodel group.&.Compared with themetformin group.

组别（Groups) 0周（0 week) 2周（2 weeks) 4周（4 weeks)模型组（Model group) 5.79±0.20##5.81±0.19 5.89±0.35两色金鸡菊醇提物高剂量组（High dose group) 5.91±0.26##5.47±0.30*&5.42±0.34**两色金鸡菊醇提物中剂量组（Moderate dose group) 6.03±0.60##5.44±0.55*&5.61±0.37*二甲双胍对照组（Metformin group) 5.99±0.11##6.11±0.50**5.53±0.34*空白对照组（Blank group) 5.35±0.30 5.32±0.19**5.39±0.34**

表2 五组样本中多形拟杆菌起始模板量对数值比较（±s，n=10)Tab.2 Numeric comparisons of Bacteroides thetaiotaomicron starting template in the samples of five groups（±s，n=10)

表2 五组样本中多形拟杆菌起始模板量对数值比较（±s，n=10)Tab.2 Numeric comparisons of Bacteroides thetaiotaomicron starting template in the samples of five groups（±s，n=10)

注:#:与空白对照组比较；*:与模型组比较；&:与二甲双胍对照组比较。Note.#.Compared with the blank group.*.Compared with themodel group.&.Compared with themetformin group.

组别（Groups) 0周（0 week) 2周（2 weeks) 4周（4 weeks)模型组（Model group) 4.45±0.32#4.63±0.16 4.97±0.37两色金鸡菊醇提物高剂量组（Hight dose group) 4.38±0.51#4.16±0.32**4.44±0.16*两色金鸡菊醇提物中剂量组（Moderate dose group) 4.44±0.26#4.71±0.12 4.46±0.29*二甲双胍对照组（Metformin group) 4.30±0.45#4.46±0.05*4.46±0.47*空白对照组（Blank group) 4.80±0.13 4.53±0.40*4.55±0.35*

图1 球形梭菌荧光定量PCR检测图Fig.1 Quantitative real-time PCR detection of Clostridium coccoides

图2 多形拟杆菌荧光定量PCR检测图Fig.2 Quantitative real-time PCR detection of Bacteroides thetaiotaomicron

图3 四组样本中球形梭菌（A)、多形拟杆菌（B)水平与空腹血糖水平的相关性Fig.3 The correlation of Clostridium coccoides（A)and Bacteroides thetaiotaomicron（B)with fasting glucose level in the four groups.

3 讨论

实时荧光定量PCR（RTFQ-PCR)是20世纪90年代推出的技术，其利用染料和双链DNA结合，在PCR反应过程中荧光信号的改变来进行定量。相对于传统的菌群检测方法，RTFQ-PCR具有更高的灵敏度及特异度，并且操作简单快速，近年来已逐步成为检测菌群的主要手段。

本研究针对肠道菌群中球形梭菌和拟杆菌，进行RTFQ-PCR检测，比较各组之间小鼠肠道菌群表达的差异，得出以下结果:①与正常组比较，模型组中球形梭菌与多形拟杆菌水平均增高。②两色金鸡菊醇提物高剂量组与模型组相比，球形梭菌与多形拟杆菌的水平下降，且有统计学差异。③球形梭菌水平、多形拟杆菌水平均与FBG水平呈正相关。

球形梭菌是肠道内最为常见的类群之一。研究表明，这个类群的大部分细菌能帮助宿主从饮食中吸收能量，从而与肥胖、糖尿病代谢性疾病的发生相关[16］。厚壁菌门具有降解人体所不能降解的多糖进而为人体提供能量的作用。Gordon等[17］也发现的肥胖人群中肠道球形梭菌增多并提示其与能量代谢有一定关系。同时多形拟杆菌也有降解多糖的能力，提高人体对营养物质的吸收与利用[18］。张丽萍等[19］的研究显示，多形拟杆菌可使宿主更为高效的吸收糖。同时Nadja等的研究发现，糖尿病患者和正常患者相比，其拟杆菌水平与血糖呈正相关，即血糖水平随拟杆菌数量的增高而增高[20］。在这基础之上，谢婧雯等[21］的研究也初步提示，多形拟杆菌与血糖水平存在正相关。以上的研究得到的成果与本实验得出的结论相似。

两色金鸡菊作为新疆地方特色药物，其药用价值正在被逐渐发现，近年来越来越多的研究提示，两色金鸡菊具有降糖作用[14，22-24］，其机制可能与其抑制α-葡萄糖苷酶有关，但目前尚未明确，故本研究拟通过其对肠道菌群的影响发现其可能的药理机制。在本研究中，通过对两色金鸡菊醇提物高剂量组与其他各组之间多形拟杆菌、球形梭菌水平进行比较，发现:两色金鸡菊醇提物干预组多形拟杆菌、球形梭菌水平较模型组表达均下降，且有统计学差异，但与正常对照组及二甲双胍阳性对照组并无差异，这可能提示着，两色金鸡菊醇提物对肠道菌群具有一定的保护作用，是其趋于正常。同时，与当今主流降糖药物二甲双胍作对比，并没有发现其具有统计学差异（给药4周)，表明其降糖效果及对肠道菌群的影响与二甲双胍类似，证明其功效在一定程度上可信。与此同时，发现菌群表达水平与血糖高低存在正相关性。可能提示，菌群数量的改变与血糖升高程度有一定的相关因素，但尚不能明确。

通过上述的研究，可以做出初步推断即两色金鸡菊醇提物对于T2DM小鼠具有一定的降糖功效，其功能的实现可能与其对肠道菌群表达水平的影响存在着一定的联系，可能的机制为保护了肠道益生菌并抑制有害菌的表达水平。具体机制的确定以待进一步研究证明，课题组将继续以肠道菌群为突破口，研究其具体的药理机制。

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Effect of alcohol extract of Coreopsis tinctoria Nutt on intestinal flora in tjpe 2 diabetic m ice

ZHANG Kai-nan1，LONG Mei2，RAN Xin-jian2，YANG Ying1，TONG Lei1，LIQing-cheng1，XIONG Jian-hui3，MAO Xin-min4，TAO Liang3，LILin-lin3*
（1.The Clinical Medical School，2.Central Laboratory of Functional Activities，3.Department of Pharmacology，4.The School of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumchi830054，China)

ObjectiveTo study the differences in intestinal flora of normal and type 2 diabetic mice，the effect of alcoholic extractof Coreopsis tinctoria Nuttonmouse intestinal flora，and explore the possible relationship between alcoholic extract of Coreopsis tinctoria Nutt，intestinal flora and type 2 diabetesmellitus（T2DM)inmice.MethodsStool samples were collected from the normal control group（A)，high dose（1.8 g/kg)（B)and moderate dose（1.2 g/kg)（C)alcoholic extract of Coreopsis tinctoria Nuttmodel groups，metformin（0.2 g/kg)treatment group（D)and blank control（E) group.16S rDNA real-time quantitative PCR assay was used to determine the levels of Clostridium coccoides and Bacteroides thetaiotaomicron in the stool samples.Pearson analysismethod was used to analyze the correlation between the levels of target bacterial species and the fasting blood glucose（FBG)in the mice.Results1.Compared with the normal control group，the levels of Clostridium coccoides and Bacteroides thetaiotaomicron in the T2DM model group were significantly lowered（P=0.017，P=0.002).2.Compared with themodel group，the levels of Clostridium coccoides and Bacteroides thetaiotaomicron of the high dose Coreopsis tinctoria Nutt alcohol extract group were significantly different（2 weeks:P = 0.027，P=0.006；4 weeks:P=0.007，P=0.012).3.The levels of Clostridium coccoides and Bacteroides thetaiotaomi-cron were positively correlated with the FBG level in themice.ConclusionsThe alcohol extract of Coreopsis tinctoria Nutt has certain effect on the intestinal flora in type 2 diabeticmice and there is certain correlation between the effect of alcohol extract of Coreopsis tinctoria Nutt and their blood glucose level.

Clostridium coccoides；Bacteroides thetaiotaomicron；Type 2 diabetesmellitus:Real-time PCR

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0628-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.016

2015-06-16

新疆创新药物临床前药效学评价技术平台建设（201233150)；SRTP（20140760002)。

张凯楠（1991-)，男，从事糖尿病药理研究，Tel:15699220218，E-mail:296177817@qq.com。

李琳琳，教授，邮箱:yz-lll@vip.sina.com，研究方向:糖尿病药理。