桔梗皂苷D对人乳腺癌细胞体外杀伤效应及机制研究

章英宏

桔梗皂苷D对人乳腺癌细胞体外杀伤效应及机制研究

章英宏

目的 探讨桔梗皂苷D对人乳腺癌细胞体外杀伤效应及机制。方法 将人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231用桔梗皂苷D干预后，采用MTT法检测桔梗皂苷D对这两种乳腺癌细胞系的抑制率；采用流式细胞术检测桔梗皂苷D对MCF-7细胞凋亡的影响；Western blot法检测桔梗皂苷D干预后MCF-7细胞caspase-3、Bcl-2和Bax表达水平。结果 MCF-7细胞抑制率：2.5μg/ mL桔梗皂苷D组（8.9±2.4）%，5μg/mL桔梗皂苷D组（24.6±3.6）%，10μg/mL桔梗皂苷D组（39.7± 4.1）%，20μg/mL桔梗皂苷D组（64.8±5.2）%，40μg/mL桔梗皂苷D组（82.4±6.5）%；MDA-MB-231细胞抑制率：2.5μg/mL桔梗皂苷D组（5.3±1.7）%，5μg/mL桔梗皂苷D组（17.3±2.9）%，10μg/mL桔梗皂苷D组（28.4±3.5）%，20μg/mL桔梗皂苷D组（50.5±4.0）%，40μg/mL桔梗皂苷D组（71.3± 6.1）%，与对照组比较，差异有统计学意义（P均＜0.05）；MCF-7细胞的凋亡诱导率：5μg/mL桔梗皂苷D组为（9.7±1.6）%，20μg/mL桔梗皂苷D组（29.8±3.1）%，高、低剂量桔梗皂苷D组与对照组比较，差异有统计学意义（P均＜0.05）；与相同剂量桔梗皂苷D组比较，zVAD-fmk可有效抑制桔梗皂苷D对MCF-7细胞的凋亡诱导效应（P＜0.05）；桔梗皂苷D能显著降低MCF-7细胞Bcl-2表达水平（0.43±0.07、0.24±0.04 vs 0.78±0.09，P均＜0.05），但对Bax表达无影响（0.38±0.05、0.41±0.04 vs 0.42±0.05，P＞0.05）。结论 桔梗皂苷D诱导乳腺癌细胞进入caspase-3依赖的凋亡过程，其机制可能与降低Bcl-2表达，降低Bcl-2/Bax比例有关。

乳腺癌；桔梗皂苷D；凋亡；caspase-3；Bcl-2；Bax

KEY WORDSbreast cancer;platycodin D;apoptosis;caspase-3;Bcl-2;Bax

目前临床治疗乳腺癌的方法包括手术切除、化疗、放疗和生物治疗，然而由于乳腺癌的高转移性和耐药性，这些治疗方法都无法治愈乳腺癌[1-2]。本研究观察桔梗皂苷D对人乳腺癌体外杀伤效应，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人乳腺癌细胞系MCF-7和MDAMB-231购于上海中科院细胞库，培养在RPMI-1640培养基中，含10%胎牛血清，培养环境为37℃恒温且通入5%的CO2。

1.2 试 剂 RPIM-1640培养基购自于美国Gibco公司，胎牛血清于杭州四季青生物工程有限公司。桔梗皂苷D，MTT（噻唑蓝），AnnexinⅤ-FITC凋亡试剂盒购于美国Sigma公司。Cleaved caspase-3、βactin、Bcl-2，Bax兔抗人抗体购自美国Cell signaling公司。

1.3 MTT法检测桔梗皂苷D对乳腺癌细胞系的抑制活性 将MCF-7，MDA-MB-231细胞分别接种于96孔板，设置3个复孔，分别加入2.5、5、10、20、40μg/mL的桔梗皂苷D培养48h，对照组为相同培养条件下不加桔梗皂苷D培养48h。之后加5mg/mL MTT 20μL，继续培养4h。弃上清，往孔中加150μL二甲亚砜，570nm波长下检测OD值，细胞生长抑制率按以下公式计算：抑制率=[OD（对照组）-OD（药物组）/OD（对照组）]×100%。

1.4 细胞凋亡试验 MCF-7细胞凋亡检测分组如下：5μg/mL桔梗皂苷D组，20μg/mL桔梗皂苷D组，5μg/mL桔梗皂苷D+10μmol/L zVAD-fmk组，20μg/ mL桔梗皂苷D+10μmol/L zVAD-fmk组。分组加药后培养48h，对照组为不加药物培养48h。收集细胞，用生理盐水洗2次，加195μL凋亡试剂盒中的结合缓冲液及5μL Annexin-V在暗处孵育10min，之后加入10μL碘化丙啶（PI）孵育10min，用流式细胞仪检测MCF-7细胞凋亡，凋亡率为Annexin V阳性细胞占所有细胞的比例。

1.5 Western blot试验 在MCF-7细胞中分别加入5μg/mL或20μg/mL桔梗皂苷D培养48h，对照组为不加药物培养48h，收集细胞，将细胞裂解后取裂解液进行聚丙烯酰氨凝胶电脉（SDS-PAGE），之后将分离后的蛋白转到PVDF膜上，将膜在Cleaved caspase-3，β-actin，Bcl-2或Bax一抗稀释液中孵育过夜，将膜清洗后在羊抗兔二抗稀释液中孵育2h，用ECL显色试剂盒显色，X线胶片曝光后，目标蛋白表达量由它们在胶片上显色后的灰度与相应β-actin的灰度比表示。

1.6 统计学方法 所有实验重复3次，实验数据用均值±标准差（±s） 表示，应用SPSS13.0软件进行统计处理，采用t检验以及单因素方差分析。

2 结 果

2.1 桔梗皂苷D对人乳腺癌细胞系的抑制作用 与不加桔梗皂苷D的对照组比较，不同剂量的桔梗皂苷D均能明显抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的生长（P＜0.05），且MCF-7细胞对桔梗皂苷D的敏感性高于MDA-MB-231细胞系（P＜0.05），见表1。

2.2 桔梗皂苷D诱导MCF-7细胞凋亡 高、低剂量的桔梗皂苷D均能显著诱导MCF-7细胞caspase-3的活化，使激活型（cleaved caspase-3）表达显著增加，进而诱导MCF-7细胞发生凋亡（P＜0.05）。caspase特异性抑制剂zVAD-fmk能显著抑制桔梗皂苷D诱导的caspase-3活化和凋亡的发生（P＜0.05），见表2。

2.3 桔梗皂苷D下调Bcl-2表达 与不加桔梗皂苷D的对照组比较，高、低剂量的桔梗皂苷D均可显著抑制MCF-7细胞Bcl-2表达（P＜0.05），但对Bax表达无影响（P＞0.05）。高、低剂量桔梗皂苷D均使MCF-7细胞的Bcl-2/Bax比值下降，见表3。

表1 桔梗皂苷D体外MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞抑制作用（±s）

表1 桔梗皂苷D体外MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞抑制作用（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与同浓度桔梗皂苷D处理的MCF-7比较，△P＜0.05

组别对照组2.5μg/mL桔梗皂苷D组5μg/mL桔梗皂苷D组10μg/mL桔梗皂苷D组20μg/mL桔梗皂苷D组40μg/mL桔梗皂苷D组孔数333333桔梗皂苷D浓度（μg/mL）0 2.5 5 10 20 40 MCF-7细胞抑制率（%）0 8.9±2.4* 24.6±3.6* 39.7±4.1* 64.8±5.2* 82.4±6.5* MDA-MB-231细胞抑制率（%）0 5.3±1.7* 17.3±2.9*△28.4±3.5*△50.5±4.0*△71.3±6.1*△

表2 桔梗皂苷D对MCF-7细胞凋亡的影响（±s）

表2 桔梗皂苷D对MCF-7细胞凋亡的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与5μg/mL桔梗皂苷D组比较，▲P＜0.05；与20μg/mL桔梗皂苷D组比较，#P＜0.05

组别对照组5μg/mL桔梗皂苷D组20μg/mL桔梗皂苷D组5μg/mL桔梗皂苷D+zVAD-fmk组20μg/mL桔梗皂苷D+zVAD-fmk组孔数 桔梗皂苷D浓度（μg/mL）zVAD-fmk浓度（μmol/L）33333 05 20 5 20 0001 0 10凋亡率（%）1.8±0.3 9.7±1.6* 29.8±3.1* 3.8±1.1▲8.9±1.5*#灰度比（cleaved caspase-3/β-actin）0.08±0.02 0.21±0.06* 0.42±0.11* 0.12±0.03▲0.19±0.04*#

表3 桔梗皂苷D对MCF-7细胞Bcl-2及Bax蛋白表达的影响（±s）

表3 桔梗皂苷D对MCF-7细胞Bcl-2及Bax蛋白表达的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别对照组5μg/mL桔梗皂苷D组20μg/mL桔梗皂苷D组孔数 桔梗皂苷D浓度（μg/mL）333 052 0灰度比（Bcl-2/β-actin）0.78±0.09 0.43±0.07* 0.24±0.04*灰度比（Bax/β-actin）0.42±0.05 0.38±0.05 0.41±0.04 Bcl-2/Bax 1.86±0.18 1.13±0.08 0.59±0.06

3 讨论

桔梗皂苷D是桔梗总皂苷的主要活性成分，具有抗炎、镇痛和免疫调节的作用，最近也有文献报道桔梗皂苷D具有显著的抗肝癌和肺癌的生物活性，能诱导肝癌和肺癌细胞凋亡和周期阻滞[3-5]。

诱导肿瘤细胞发生凋亡是肿瘤治疗药物杀伤肿瘤细胞的关键机制，能否显著造成肿瘤细胞凋亡往往是肿瘤药物治疗成功与否的标志，而肿瘤细胞对化疗药物的抵抗则常常表现为对凋亡的抵抗[6-7]。本实验结果发现桔梗皂苷D能诱导MCF-7细胞caspase-3的活化同时显著诱导MCF-7细胞发生凋亡，当用zVAD-fmk抑制caspase-3的活化后，桔梗皂苷D对MCF-7细胞的凋亡诱导效应下降。证实桔梗皂苷D能诱导乳腺癌细胞凋亡，且依赖于caspase-3的活化。

Bcl-2蛋白家族是细胞内重要的凋亡调控因子，当Bcl-2与Bax的比值下降时，细胞线粒体膜孔道会开放，细胞色素C释出，进而激活caspase-3，导致细胞发生凋亡[8-9]。Western blot检测结果发现桔梗皂苷D尽管不能诱导Bax表达，但能显著增加Bcl-2表达水平，使Bcl-2/Bax比值显著下降。这可能是桔梗皂苷D诱导MCF-7细胞凋亡的作用机制之一。

综上所述，桔梗皂苷D具有良好的体外抗乳腺癌生长的活性，并能诱导乳腺癌细胞发生凋亡。

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（收稿：2014-12-26 修回：2015-02-14）

Viability Inhibition of Human Breast Cancer Cells Treated w ith Platycodin D in Vitro and the UnderlyingM echanism

ZHANG Yinghong. Clinical Laboratory,Xinchang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Xingchang(312500),China

Objective To investigate the anticancer activity of platycodin D in breast cancer cells and the mechanism.M ethods Human breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 were treated with platycodin D. Cell viability was then measured by using the MTT assay.Apoptosis of MCF-7 treated with platycodin D was determined by flow cytometry.The expression of cleaved caspase-3,Bcl-2 and Bax on MCF-7 was detected by western blot.Results The viability inhibition rate of MCF-7 were as follows:8.9%±2.4%in 2.5μg/mL platycodin D group，24.6%±3.6%in 5μg/mL platycodin D group,39.7%±4.1%in 10μg/mL platycodin D group,64.8%±5.2% in 20μg/mL platycodin D group,82.4%±6.5%in 40μg/mL platycodin D group.The viability inhibition rate of MDA-MB-231 were as follows:5.3%±1.7%in 2.5μg/mL platycodin D group,17.3%±2.9%in 5μg/mL platycodin D group,28.4%±3.5%in 10μg/mL platycodin D group,50.5%±4.0%in 20μg/mL platycodin D group,71.3%± 6.1%in 40μg/mL platycodin D group.Statistical differences was found between MCF-7 and MDA-MB-231 treated with platycodin D group and control group（P＜0.05）.The apoptosis rate of MCF-7 cells was 9.7%±1.6%in 5μg/mL platycodin D group and 29.8%±3.1%in 20μg/mL platycodin D group,which were significantly different from that of control group（P＜0.05）.Compared to the equal dose of platycodin D group,Zvad-fmk significantly inhibited the apoptosis induced by platycodin D（P＜0.05）.Pplatycodin D decreased the expression of Bcl-2 on MCF-7 cells（0.43±0.07 and 0.24±0.04 vs 0.78±0.09,P＜0.05）,while it did not affect the expression of Bax on MCF-7 cells（0.38±0.05 and 0.41±0.04 vs 0.42±0.05,P＞0.05）. Conclusion Platycodin D can induce caspase-3-dependant apoptosis of breast cancer cells by down-regulating the expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2 to Bax.

浙江省新昌县中医院检验科（新昌 312500）