重组人γ-干扰素在耐多药结核病小鼠治疗作用中的研究

侯江厚 李琦 张灵霞 王仲元 孙卫国 赵伟杰 操敏



·论著·

重组人γ-干扰素在耐多药结核病小鼠治疗作用中的研究

侯江厚 李琦 张灵霞 王仲元 孙卫国 赵伟杰 操敏

目的 探讨重组人γ-干扰素(rh-IFN-γ)在MDR-TB小鼠中的治疗作用及其免疫学机制。方法 72只成年雄性Balb/c小鼠，用含耐多药Mtb的气溶胶感染，感染后第2天处死4只以确定小鼠肺脏植入的菌量，感染后21 d(设定治疗0周)脱颈处死4只小鼠作空白对照；余下64只小鼠采用随机数字表法分为对照组、rh-IFN-γ组、莫西沙星组和联合治疗组(莫西沙星+ rh-IFN-γ)，每组16只，于治疗0周开始给药。治疗4、8、16、20周各组分别脱颈处死4只，以测定小鼠的肺、脾质量指数和肺、脾菌落形成单位(CFU)、8周血清细胞因子IFN-γ和白细胞介素(IL)-10的水平。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用SNK法和Games-Howell法。 结果 肺脾质量指数：莫西沙星组8周肺指数为“5.99±0.72”、低于对照组的“8.01±0.91”(F=6.28，P<0.01)；莫西沙星组8周脾指数为“2.87±0.15”，低于对照组的“3.87±0.41”(F=8.37，P<0.01)。肺、脾CFU：莫西沙星组、联合治疗组4周肺组织CFU分别为(4.37±0.20)lg CFU/ml和(4.35±0.18)lg CFU/ml，均低于对照组[(5.30±0.21)lg CFU/ml]和rh-IFN-γ组[(5.29±0.13)lg CFU/ml](F=35.55，P<0.01)，莫西沙星组、联合治疗组8周肺组织CFU分别为(2.86±0.29)lg CFU/ml和(2.63±0.08)lg CFU/ml，均低于对照组[(5.00±0.23)lg CFU/ml]和rh-IFN-γ组[(4.82±0.55)lg CFU/ml](F=56.83，P<0.01)，且均于16周始无菌化(即无Mtb生长)；rh-IFN-γ组20周脾组织CFU为(3.21±0.40)lg CFU，低于对照组的(4.31±0.06)lg CFU/ml(t=5.45，P<0.01)；莫西沙星组和联合治疗组的脾组织从4周始无菌化。治疗8周小鼠血清γ-干扰素和IL-10的水平：rh-IFN-γ组、莫西沙星组和联合治疗组血清IFN-γ水平分别为(3.40±0.64)ng/L、(1.32±0.53)ng/L和(0.47±0.44)ng/L，低于对照组的(10.34±2.09)ng/L(F=55.973，P<0.01)，莫西沙星组和联合治疗组血清IFN-γ水平分别为(1.32±0.53)ng/L和(0.47±0.44)ng/L，低于rh-IFN-γ组的(3.40±0.64)ng/L(F=55.973，P<0.01)。 对照组、rh-IFN-γ组、莫西沙星组和联合治疗组血清IL-10水平分别为(6.68±1.30)ng/L、(9.76±3.97)ng/L、(8.74±4.48)ng/L和(21.34±17.58)ng/L，差异无统计学意义(F=2.013，P>0.05)。 结论 rh-IFN-γ可降低MDR-TB小鼠脾组织的菌量负荷，下调小鼠血清γ-干扰素水平，但对降低肺组织的菌量负荷和减轻肺脾组织炎症上无明显作用。rh-IFN-γ辅助莫西沙星治疗耐多药结核病小鼠，在降低病变器官的菌量负荷和减轻炎症方面无辅助作用。

结核, 抗多种药物性/药物疗法； 干扰素γ； 小鼠

γ-干扰素(IFN-γ)是机体控制结核病感染最重要的保护性免疫细胞因子之一[1]，它能通过多条途径促进巨噬细胞活化，诱导自噬[2]、一氧化氮的产生[3]及细胞凋亡[4]来清除杀灭Mtb。MDR-TB患者体内IFN-γ水平低于健康人群和对药物敏感的结核病患者[5]，分泌IFN-γ的CD4+T淋巴细胞频数也低于健康人群和对药物敏感的结核病患者[6]，因此，给MDR-TB患者补充外源性IFN-γ可能有助于杀灭Mtb。本实验采用重组人γ-干扰素(rh-IFN-γ)治疗MDR-TB小鼠，探讨其对MDR-TB小鼠的治疗作用及其免疫学机制，为临床MDR-TB患者的免疫治疗提供实验基础。

材料和方法

一、材料

雄性6～8周龄清洁级Balb/c小鼠72只，体质量18～20 g，购自中国药品生物制品检定所实验动物中心。羧甲基纤维素钠(CMC)(国药集团化学试剂有限公司生产)，rh-IFN-γ(100万U/支，由上海凯茂生物医药有限公司生产)；莫西沙星(0.4 g/片，拜耳医药保健股份公司生产)；异烟肼低度耐药、利福平高度耐药Mtb临床菌株(北京结核病胸部肿瘤研究所药物研究室提供)，鼠源IFN-γ和白细胞介素(IL)-10的酶联免疫吸附试验试剂盒(美国R&D公司提供；批号：272899和269773)。负压感染实验动物房由北京市结核病胸部肿瘤研究所提供。

二、方法

1．模型建立和给药方法：用含有耐多药 Mtb的7H9液体培养基共10 ml[在450 nm处的吸光度值(A值)约为0.8]，在气溶胶感染装置中建立气溶胶感染小鼠MDR-TB模型[7]。小鼠感染后21 d开始给药(设定为治疗0周)，按照药品说明书或相关文献，以及小鼠体质量设计给药方法，具体为：CMC(浓度为0.5%)0.2 ml/只，1次/d，灌胃[8]；rh-IFN-γ 1万U · kg-1·d-1，皮下注射，2次/周(周二、五)[9]；莫西沙星100 mg· kg-1·d-1，灌胃，1次/d，5次/周(周一至周五)[10]。

2．动物分组、处置和标本采集：72只BALB/c小鼠感染后第2天处死4只，确定小鼠肺脏感染耐多药 Mtb的菌量，感染后21 d(治疗0周)处死4只小鼠；余下64只小鼠采用随机数字表法分为对照组、rh-IFN-γ组、莫西沙星组和联合治疗组(莫西沙星+ rh-IFN-γ)，每组16只，并于当天开始给药，对照组给予CMC灌胃，rh-IFN-γ组给予rh-IFN-γ皮下注射，莫西沙星组给予莫西沙星灌胃，联合治疗组给予莫西沙星灌胃和rh-IFN-γ皮下注射；治疗4、8、16、20周各组分别脱颈处死小鼠4只，每次处死的小鼠均取全肺和整脾，治疗8周处死的小鼠还取静脉血，在离心半径6 cm，4000 r/min离心10 min后取上层血清于-80 ℃下保存。

3. 肺指数和脾指数计算：每次处死的小鼠均取全肺和整脾，同时称取体质量、肺质量和脾质量，计算肺质量指数和脾质量指数。肺质量指数=肺质量(mg)/体质量(g)；脾质量指数=脾质量(mg)/体质量(g)。

4. 菌落形成单位(CFU)计数：每次处死小鼠后对取出的肺脏和脾脏立即进行均浆，按一定比例稀释，接种7H11培养基，于37 ℃培养4周，记录菌落形成单位，计算整肺和全脾组织中的CFU。

5. 血清IFN-γ和IL-10检测：采用酶联免疫吸附试验法检测血清中的IFN-γ和IL-10的浓度。严格按照说明书要求操作，酶标仪450 nm处测吸光度(A值)，建立标准曲线，求其A值。为了避免rh-IFN-γ对小鼠血清IFN-γ的检测产生影响，我们处死小鼠的时间都是在周一，因为rh-IFN-γ皮下注射时间都是在周二、五，皮下注射的半衰期为9.35 h，故不影响小鼠自身血清IFN-γ的检测。

三、统计学处理

结 果

1．rh-IFN-γ对小鼠肺质量指数和脾质量指数的影响：仅莫西沙星组8周肺、脾指数均低于对照组(P<0.05)。rh-IFN-γ组和对照组各时间段肺、脾质量指数差异无统计学意义(P>0.05)，莫西沙星组和联合治疗组各时间段肺、脾质量指数差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

2．rh-IFN-γ对小鼠肺组织Mtb活菌计数(CFU)的影响：感染后第2天小鼠肺组织的菌量为[(2.96±0.06)lg CFU/ml]。对照组8、16、20周肺组织CFU均较其0周降低(P值均<0.05或<0.01)，rh-IFN-γ组各时间段肺组织CFU与对照组差异无统计学意义(P值均>0.05)，莫西沙星组、联合治疗组各时间段肺组织CFU低于对照组和rh-IFN-γ组(P值均<0.01)，且均于16周始无Mtb生长，但莫西沙星组、联合治疗组各时间段肺组织CFU差异无统计学意义(P值均>0.05)(表2)。

表1 4组小鼠肺质量指数和脾质量指数在不同时间点的变化

注 与对照组比较，a:P值均<0.05；莫西沙星组和联合治疗组小鼠16周始肺脾组织无Mtb生长，故20周时未检测肺脾指数。“-”表示未做肺、脾指数检测

表2 4组小鼠肺组织培养不同时间点的菌落计数变化

注 与肺组织菌落计数0周比较，a:P<0.05；b:P<0.01；与对照组比较，c:P<0.01，d:P<0.01；与rh-IFN-γ组比较，d:P<0.01。“-”表示无Mtb生长

表3 4组小鼠脾组织培养菌落计数在不同时间点的变化

注 与对照组比较，a：F=5.45，P<0.01。“-”表示无Mtb生长

3．rh-IFN-γ对小鼠脾组织Mtb活菌计数(CFU)的影响：rh-IFN-γ组20周脾组织CFU低于对照组(P<0.01)。莫西沙星组和联合治疗组的脾组织从4周始无Mtb生长(表3)。

4． rh-IFN-γ治疗8周时对小鼠血清IFN-γ和IL-10水平的影响：rh-IFN-γ组、莫西沙星组和联合治疗组血清IFN-γ水平低于对照组(P<0.05或0.01)，莫西沙星组和联合治疗组血清IFN-γ水平低于rh-IFN-γ组(P<0.01)，但莫西沙星组和联合治疗组血清IFN-γ差异无统计学意义(P>0.05)。此外，4个观察组血清IL-10水平差异无统计学意义(F=2.013，P>0.05)(表4)。

表4 4组小鼠治疗8周时血清IFN-γ和IL-10水平的比较

注 与对照组比较，a：F=55.973，P<0.05，b：F=55.973，P<0.01；与rh-IFN-γ组比较，c：F=55.973，P<0.05，d：F=55.973，P<0.01。4个组血清IL-10水平差异均无统计学意义(F=2.013，P值均>0.05)

讨 论

IFN-γ是体内巨噬细胞活化和免疫保护必不可少的细胞因子[1,11]，也是诱导自噬产生的关键性细胞因子之一。由巨噬细胞、活化T细胞、自然杀伤细胞和白细胞产生。Gao等[12]采用系统性回顾研究9例IFN-γ联合抗结核药物治疗的肺结核患者，发现IFN-γ辅助抗结核药物能促进肺结核患者痰菌转阴和肺部病变面积缩小。华树成等[13]用IFN-γ治疗结核分枝杆菌H37Rv感染的小鼠7周，发现IFN-γ能减轻肺组织炎症，降低肺组织中的菌量负荷和肺组织中的IFN-γmRNA水平。以上这些研究提示rh-IFN-γ能调节对药物敏感的结核病患者的免疫，具有一定的治疗作用或辅助性治疗作用。然而，MDR-TB患者和对药物敏感的结核病患者的机体免疫存在着差别[5-6]，rh-IFN-γ在MDR-TB患者中是否有作用并没有做过系统性的基础研究。

从表1可见， rh-IFN-γ单独或者辅助莫西沙星治疗MDR-TB小鼠时，均不能降低小鼠肺脾质量指数，减轻小鼠肺脾组织的炎症。这可能是耐多药Mtb的毒力较敏感菌株H37Rv弱[5]，使所有感染小鼠的肺脾组织炎症程度较轻，从而观察不出rh-IFN-γ减轻炎症的作用。从莫西沙星组和联合治疗组的肺脾质量指数也可以看出， 治疗16周莫西沙星组和联合治疗组肺脾组织无Mtb生长，肺脾组织基本无炎性病变，而此时4个组的肺、脾质量指数均相接近(P值均>0.05)，说明对照组肺与脾的炎症程度较轻，从而看不出rh-IFN-γ和莫西沙星在减轻炎症方面的作用了。

从表2、3看出，rh-IFN-γ对抑制和杀灭耐多药结核分枝杆菌有影响。rh-IFN-γ降低小鼠20周脾组织的CFU，说明rh-IFN-γ主要作用于脾脏，可能是脾脏为机体最大的免疫器官，含有大量的淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心，便于rh-IFN-γ通过多种机制诱导自噬和一氧化氮的产生[2]，从而杀灭耐多药结核分枝杆菌。

IFN-γ是机体抗感染关键性保护因子，它通过影响包括2000多个基因的转录程序来发挥这种作用。这些转录因子标志中最突出的是鸟苷三磷酸酶(GTPases)家族[14]，这个家族包括相对分子质量为47 000(47 kDa)与免疫相关的GTPases(P47IRGs)，相对分子质量为65 000～73 000(65～73 kD)的鸟苷酸结合蛋白(P65GbPs)，和相对分子质量为285 000(285 kD)的可诱导的GTPases(Vligs/Gvins)。IFN-γ主要通过影响P47IRGs和P65GbPs来诱导自噬的。

小鼠中P47IRGs有24个基因，其中包括20个受干扰素调控的完整干扰素调节基因(interferon-regulated genes，IRGs)和2个假基因(Irgm 1～3、Irga 1～8、Irgb 1～10和Irgd)，2个与免疫无关的基因(Irgc和Irgq)[2]。小鼠的Irgb 6、Irgd、Irgm 1～3和Irga 6基因参与防御细胞内的Mtb，特别是Irgm 1在抗细胞内Mtb过程中起着重要的保护作用，在清除小鼠巨噬细胞内的Mtb时，Irgm 1是依赖IFN-γ的效应器和自噬调节器。小鼠巨噬细胞中的Irgm 1基因通过IFN-γ活化，诱导自噬清除Mtb[2]。

P65GbPs中的GbP1、GbP6、GbP7和GbP10与细胞的自主免疫和巨噬细胞抗Mtb密切相关。这些GbPs能被IFN-γ活化，能够触发宿主防御蛋白，包括巨噬细胞氧化酶，抗菌肽，自噬效应因子，杀死细胞内的Mtb[14]。

从表4看出，rh-IFN-γ调节抗炎细胞因子的分泌，本实验结果显示在rh-IFN-γ治疗8周时，rh-IFN-γ组小鼠机体分泌的IFN-γ水平低于对照组(P<0.05)，可能与rh-IFN-γ诱导的自噬能抑制IL-1β的表达[15]相关。IL-1β诱导T(H)17生成IFN-γ[16]，故IL-1β受到抑制时IFN-γ的生成也减少。

IFN-γ存在种属特异性，用人源IFN-γ来治疗耐多药结核病小鼠可能影响治疗效果，因而下一步需要用鼠源IFN-γ来印证此实验结果的准确性。

综上所述，rh-IFN-γ可降低MDR-TB小鼠脾组织的菌量负荷，下调小鼠血清IFN-γ水平，但对降低肺组织的菌量负荷和减轻肺脾组织炎症上无明显作用。rh-IFN-γ辅助莫西沙星治疗耐多药结核病小鼠，在降低病变器官的菌量负荷和减轻炎症方面无辅助作用。

[1] O’Garra A, Redford PS, McNab FW, et al. The immune response in tuberculosis. Annu Rev Immunol，2013，31:475-527.

[2] 侯江厚，李琦.自噬在结核病免疫应答中的作用.中华结核和呼吸杂志,2012,35(3)：206-209.

[3] Liao D, Fan Q, Bao L. The role of superoxide dismutase in the survival ofMycobacteriumtuberculosisin macrophages. Jpn J Infect Dis，2013，66(6):480-488.

[4] Herbst S, Schaible UE, Schneider BE. Interferon gamma activated macrophages kill mycobacteria by nitric oxide induced apoptosis. PLoS One，2011，6(5):e19105.

[5] Tan Q, Xie WP, Min R, et al.Characterization of Th1- and Th2-type immune response in human multidrug-resistant tuberculosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2012，31(6):1233-1242.

[6] Pinheiro RO, de Oliveira EB, Dos Santos G, et al. Different immunosuppressive mechanisms in multi-drug-resistant tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria patients. Clin Exp Immunol，2013，171(2):210-219.

[7] 徐建，陆宇，郑梅琴，等.气溶胶感染小鼠急性结核病模型的建立及应用. 中国防痨杂志,2010,32(8)：462-465.

[8] Wang J, Ji L, Liu H, et al. Study of the hepatotoxicity induced by Dioscorea bulbifera L. rhizome in mice. Biosci Trends，2010,4(2):79-85.

[9] 严玉兰.IFN-λ重组腺病毒载体的构建、转染及对肺癌影响的体内外实验研究.临床检验诊断学,2009,29(1)：107-109.

[10] Poissy J, Aubry A, Fernandez C, et al. Should Moxifloxacin Be Used for the Treatment of Extensively Drug-Resistant Tuberculosis An Answer from a Murine Model. Antimicrob agents Chemother，2010,54(11):4765-4771.

[11] Thakur A, Pedersen LE, Jungersen G. Immune markers and correlates of protection for vaccine induced immune responses. Vaccine, 2012, 30(33):4907-4920.

[12] Gao XF, Yang ZW, Li J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a syste-matic review. Int J Infect Dis, 2011,15(9):e594-600.

[13] 华树成，许力军，吕晓红,等.IFN-γ治疗结核的动物实验研究.中国老年学杂志，2002，22(5)：391-393.

[14] Kim BH, Shenoy AR, Kumar P, et al. A family of IFN-γ-inducible 65-kD GTPases protects against bacterial infection. Science，2011, 332(6030):717-721.

[15] Kleinnijenhuis J, Oosting M, Plantinga TS, et al. AutoPhagy modulates theMycobacteriumtuberculosis-induced cytokine response. Immunology，2011,134(3):341-348.

[16] Zielinski CE, Mele F, Aschenbrenner D, et al. Pathogen-induced human T(H)17 cells Produce IFN-γ or IL-10 and are regulated by IL-1β. Nature，2012;484(7395):514-518.

(本文编辑：范永德)

Study on the therapeutic effect with recombinant human IFN-γ on multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisinfected mice

HOUJiang-hou*,LIQi,ZHANGLing-xia,WANGZhong-yuan,SUNWei-guo,ZHAOWei-jie，CAOMin.

*ArmyTuberculosisPreventionandControlKeyLaboratory，BeijingKeyLaboratoryofNewTechniquesofTuberculosisDiagnosisandTreatment，InstituteforTuberculosisResearch,the309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,ChinaCorrespondingauthor:LIQi,Email:lq0703@hotmail.com

Objective To study the therapeutic effect and immunological mechanism of recombinant human interferon γ (rh-IFN-γ) in treating the mice with multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB)． Methods Seventy-two adult male Balb/c mice were infected with multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisvia aerosol. Four mice were sacrificed at second day after infection to determine the colony forming units (CFUs) implanted in the lungs. Four mice were sacrificed at 21- day post infection (0 week of treatment). The remaining 64 mice were randomly divided into control group，rh-IFN-γ group，moxifloxacin group and combination therapy group (moxifloxacin+rh-IFN-γ)，16 mice in each group，and started to give medicine treatment at 0 week of treatment．Four mice per group were sacrificed at 4-, 8-, 16- and 20- weeks of treatment, to observe the mass index and live bacteria counting (CFUs) of lung and spleen at each time-point，and to detect the levels of IFN-γ and IL-10 in sera at 8 weeks of treatment．Comparison between the two groups usedttest．Comparison among groups were tested by One-Way analysis of variance (ANOVA)，comparison in pairs within group used SNK method and Games-Howell method. Results Lung and spleen mass index：the lung mass index of moxifloxacin group (5.99±0.72)at 8 weeks were significantly lower than that of control group(8.01±0.91)(F=6.28，P<0.01)．The spleen mass index of moxifloxacin group(2.87±0.15) at 8 weeks were significantly lower than that of control group (3.87±0.41)(F=8.37，P<0.01)． Lung and spleen CFUs： the lung CFUs of moxifloxacin group [(4.37±0.20)lg/ml] and combination therapy group [(4.35±0.18)lg/ml] at 4 weeks respectively were significantly lower than that of control group [(5.30±0.21)lg/ml] and rh-IFN-γ group [(5.29±0.13)lg/ml](F=35.55，P<0.01)，the lung CFUs of moxifloxacin group [(2.86±0.29)lg/ml] and combination therapy group [(2.63±0.08)lg/ml] at 8 weeks respectively were significantly lower than that of control group [(5.00±0.23)lg/ml] and rh-IFN-γ group [(4.82±0.55)lg/ml](F=56.83，P<0.01)，and were sterile from 16 weeks (without the growth ofMycobacteriumtuberculosis)．Spleen CFUs of rh-IFN-γ group [(3.21±0.40)lg/ml] at 20 weeks were significantly lower than that of control group [(4.31±0.06)lg/ml](t=5.45，P<0.01)．Spleen tissue of moxifloxacin group and combination therapy group were sterile from 4 weeks．IFN-γ and IL-10 levels in the sera at 8 weeks：the serum IFN-γ levels of rh-IFN-γ group [(3.40±0.64)ng/L], moxifloxacin group [(1.32±0.53)ng/L] and combination therapy [(0.47±0.44)ng/L] were significantly lower than that of control group [(10.34±2.09)ng/L](F=55.973，P<0.01)， the serum IFN-γ levels of moxifloxacin group and combination therapy group respectively were obviously lower than that of rh-IFN-γ group(F=55.973，P<0.01); the serum IL-10 levels had no significant difference among control group [(6.68±1.30)ng/L]，rh-IFN-γ group [(9.76±3.97)ng/L]，moxifloxacin group [(8.74±4.48)ng/L] and combination therapy group [(21.34±17.58)ng/L](F=2.013，P>0.05)． Conclusion Rh-IFN-γ can reduce the number ofMycobacteriumtuberculosisin splenic tissue and lowered serum IFN-γ levels of MDR-TB mice，but had no significant effect on reducing the number ofMycobacteriumtuberculosisand the inflammation in lung tissue of MDR-TB mice．Rh-IFN-γ in combination with moxifloxacin had also no auxiliary role on the treatment of MDR-TB, and on reducing bacteria loads and inflammation of organs in mice.

Tuberculosis, multidrug-resistant/drug therapy； Interferon-gamma； Mice

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.03.015

“十一五”国家科技重大专项(2008ZX-10003-014)

100091北京，解放军第三○九医院结核病研究所 全军结核病防治重点实验室 结核病诊疗新技术北京市重点实验室(侯江厚、张灵霞、孙卫国)，结核三病区(王仲元)；首都医科大学附属北京胸科医院肺功能室(李琦、操敏)，药物研究室(赵伟杰)

李琦，Email：lq0703@hotmail.com

2014-06-23)