全反式维甲酸通过DOK1/PPARγ信号通路抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖*

刘　华，陈　昊，唐　照，张叶敏，李明欣，汪长华△(连云港市第一人民医院病理科，江苏连云港00;武汉大学基础医学院病理生理学教研室，湖北武汉43007)

全反式维甲酸通过DOK1/PPARγ信号通路抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖*

刘华1，陈昊1，唐照2，张叶敏2，李明欣2，汪长华2△
(1连云港市第一人民医院病理科，江苏连云港222002;2武汉大学基础医学院病理生理学教研室，湖北武汉430071)

［摘要］目的:探讨全反式维甲酸( ATRA)对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响及可能机制。方法: MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液，蛋白免疫印迹检测蛋白质的表达，MTT法和溴脱氧尿嘧啶核苷( BrdU)掺入法测定细胞增殖，TUNEL法测定细胞凋亡，携带目标基因shRNA的慢病毒用于沉默目标基因，过氧化物酶体增殖物激活受体γ( PPARγ)的活性采用商品化的试剂盒测定。结果: ATRA处理可抑制MCF-7细胞的增殖，促进其凋亡;同时，ATRA以时间依赖方式刺激停靠蛋白1( DOK1)的表达。沉默DOK1可降低ATRA对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。此外，DOK1基因沉默可抑制PPARγ的表达和活性。而PPARγ选择性抑制剂GW9662可减轻ATRA对MCF-7细胞增殖的抑制和对细胞凋亡的促进作用。结论: ATRA通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡而抑制MCF-7细胞的生存，这一作用经DOK1激活的PPARγ介导。

［关键词］全反式维甲酸;细胞增殖;细胞凋亡;停靠蛋白1; MCF-7细胞

全反式维甲酸( all-trans retinoic acid，ATRA)是一种具有广泛生物学活性、存在于生命体内的维生素A代谢中间产物，其抗肿瘤作用已在基础和临床领域得到了广泛的研究。因其具有抑制肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡、促进免疫系统抗肿瘤作用、增强肿瘤细胞对放化疗治疗敏感性等特性，ATRA已被用于某些肿瘤，如急性早幼粒细胞白血病等的临床治疗［1-2］。近年研究表明，ATRA也有可能用于各种形式乳腺癌的治疗［3］。但迄今为止，ATRA抗乳腺肿瘤的作用机制仍有待深一步的研究。

停靠蛋白( docking protein，DOK)家族包括DOK1～DOK7，在肿瘤发生、胰岛素抵抗、免疫调节等方面具有重要的调节作用［4-6］。其中，DOK1～DOK6的mRNA已被证实表达在正常乳腺组织和乳腺癌组织中［7］。我们早期的研究表明，分子量为62 kD的DOK1蛋白可与p120-RasGAP结合，从而抑制Ras-Raf-MEK-ERK信号通路［8］。由于这一特性，DOK1被认为是体内主要的抑癌基因之一［5-6］。这一结论也已得到在体研究结果的证实，缺乏DOK1、DOK2和DOK3的小鼠易于患恶性肿瘤［4］，而DOK2 和DOK6表达水平的降低与乳腺癌进展密切相关［7］。但有关DOK1在乳腺癌发生发展以及治疗中的作用并未见太多报道。

本实验研究结果发现，ATRA可通过增加DOK1的表达激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ( peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)，由此起到抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖、促进MCF-7细胞凋亡的作用。

材料和方法

1材料与试剂

ATRA、MTT和抗tubulin抗体购于Sigma; caspase-3抗体和PPARγ抗体购于CST;抗DOK1抗体和抗碱性磷酸酶标记的II抗购自Santa Cruz;溴脱氧尿嘧啶核苷( bromodeoxyuridine，BrdU)细胞增殖ELISA试剂盒购自Abcam; DMEM培养基和胎牛血清( fetal bovine serum，FBS)购自HyClone。

2实验方法

2.1MCF-7细胞培养与病毒感染人乳腺癌细胞株MCF-7细胞购自ATCC，常规培养于含10% FBS、1%青霉素/链霉素( penicillin/streptomycin，P/S)的DMEM中，培养条件为37℃、5% CO2。携带人DOK1-shRNA和对照序列的慢病毒购于Santa Cruz。MCF-7细胞的病毒感染按该公司质粒感染说明书进行。

2.2细胞增殖测定细胞增殖分别采用MTT法和BrdU掺入法测定。MTT法如下: 96孔板每孔种植1 ×103细胞，培养于100 μL含2% FBS的DMEM中。在实验结束后，去除培养液，加入150 μL新鲜无酚红培养液，50 μL浓度为0. 5 g/L的MTT，37℃培养3 h。其后，小心去除培养液，每孔加入150 μL MTT溶剂。培养板用锡纸避光，置于轨道摇床混合15 min，590 nm读取吸光度( A)。BrdU掺入法按试剂盒说明书测定。

2.3Western blot蛋白的提取与定量按本实验室以前报告的方法进行［9］。蛋白定量后的细胞裂解液与等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液混合，煮沸变性蛋白，14 000×g离心10 min，取上清行SDSPAGE。蛋白免疫印迹的基本流程如下:恒压100 V电泳，恒压100 V、140 min、4℃电转移蛋白至PVDF膜，1%牛血清白蛋白封阻1 h，I抗4°C孵育过夜，II抗室温孵育1 h，NBT/BCIP碱性磷酸酶显色试剂显色，Image-Pro Plus软件分析结果。

2.4细胞凋亡测定细胞凋亡采用TUNEL法测定，试剂盒购于Roche，具体操作按说明书进行。凋亡细胞利用Olympus FluoView FV1000共聚焦显微镜观察。为计算凋亡率，每组实验至少重复3次，每次随机取5个玻片，每个玻片随机取6个视野，计数总细胞数和阳性细胞数。

2.5PPARγ活性测定PPARγ转录因子检测试剂盒购于Abcam，按试剂盒说明书测定。

3统计学处理

所有实验至少重复3次以上，并具有相似结果。数据均采用均数±标准差( mean±SD)表示。计量资料组间比较采用Student’s t检验或单因素方差分析，计数数据按χ2检验。以P＜0. 05为有差异统计学意义。

结果

1 ATRA抑制MCF-7细胞生存

为观察ATRA对细胞增殖的影响，MCF-7细胞培养于含2% FBS、1% P/S的培养液中，同时接受1 mg/L的ATRA和同剂量对照溶剂处理5 d，MTT法和BrdU掺入法分别测定细胞活性与增殖。ATRA明显降低MTT吸光度;同时，ATRA也明显降低BrdU的掺入，表明ATRA可抑制细胞增殖。为探讨ATRA对细胞凋亡的影响，MCF-7细胞培养于含1% FBS、1% P/S和1 mg/L ATRA的DMEM中72 h，同剂量的溶剂为对照，TUNEL测定细胞凋亡。结果发现，ATRA组27. 1%的细胞呈现为凋亡阳性，而对照组凋亡阳性细胞只占3. 5%，两组比较差异显著( P＜0. 01)。与此结果相一致，ATRA处理明显增加了活化型凋亡蛋白酶3( cleaved caspase-3)的蛋白水平。这些结果提示ATRA可通过抑制增殖、促进凋亡而抑制细胞生存，见图1。

Figure 1.All-trans retinoic acid ( ATRA) suppressed proliferation and enhanced apoptosis of MCF-7 cells.Mean±SD.n =6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group.图1　全反式维甲酸抑制MCF-7细胞增殖并促进其凋亡

2 ATRA增加DOK1的表达

为观察ATRA对DOK1蛋白表达的影响，MCF-7细胞培养于含10% FBS、1% P/S的培养液中，同时分别接受1 mg/L的ATRA处理12 h、24 h、48 h和72 h。Western blot检测蛋白质的表达，结果发现ATRA以时间依赖方式增加DOK1表达。半定量分析结果表明，ATRA处理24 h以上可显著增加DOK1含量，见图2。

3 DOK1介导ATRA对MCF-7细胞生存的抑制作用

为阐明DOK1在ATRA抑制MCF-7细胞生存中的作用，我们利用携带DOK1-shRNA的慢病毒敲除DOK1的表达，其相应的携带scramble序列的慢病毒作为对照。DOK1-shRNA明显降低DOK1的表达。经携带DOK1-shRNA或scramble序列病毒处理的MCF-7细胞按前述方法分别检测细胞增殖和凋亡，结果发现DOK1-shRNA处理可提高细胞活性，增强细胞增殖，抑制细胞凋亡;同时降低了cleaved caspase-3的蛋白水平。这些结果提示DOK1介导了ATRA对MCF-7细胞增殖和凋亡的调节作用，见图3。

Figure 2.All-trans retinoic acid ( ATRA) elevated DOK1 expression in MCF-7 cells.Mean±SD.n = 4.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group.图2　全反式维甲酸增加MCF-7细胞DOK1蛋白表达

4 沉默DOK1可抑制PPARγ的表达和活性为阐明PPARγ与DOK1间的关系，我们利用蛋白免疫印迹检测DOK1沉默或对照细胞中PPARγ的表达和磷酸化，采用PPARγ转录因子测定试剂盒测定PPARγ活性。结果发现DOK1沉默细胞呈现出低的PPARγ蛋白表达、高的第112位点丝氨酸的磷酸化以及降低的PPARγ转录活性，表明DOK1对PPARγ具有正向调节作用，见图4。

Figure 3.Silence of DOK1 attenuated the anti-cancer effect of all-trans retinoic acid ( ATRA) in MCF-7 cells.Mean±SD.n = 6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05 vs ATRA-treated scramble cells.图3　沉默DOK1降低全反式维甲酸的抗肿瘤效应

5 PPARγ介导ATRA对MCF-7细胞生存的抑制作用

为探讨PPARγ是否介导ATRA对MCF-7细胞生存的抑制作用，MCF-7细胞在接受ATRA处理的同时，接受10 μmol/L PPARγ选择性抑制剂GW9662的处理，按前述方法分别检测细胞增殖和凋亡。结果发现: GW9662处理可提高细胞活性，增强细胞增殖，抑制细胞凋亡，同时降低了cleaved caspase-3的蛋白水平，见图5。这些结果提示: PPARγ在ATRA 对MCF-7细胞增殖和凋亡的调节中具有重要作用。

Figure 4.DOK1 regulated PPARγ expression and activity in MCF-7 cells.Mean±SD.n = 4.*P＜0. 05 vs scramble.图4　DOK1蛋白调节PPARγ的表达和活性

讨论

一般认为，ATRA通过其核受体而发挥作用，包括视黄酸受体( retinoic acid receptor，RAR)和维甲酸X受体( retinoid X receptor，RXR)，ATRA与受体结合将激活靶基因的转录，从而发挥其功能［1-2］。此外，研究表明其它信号通路也可介导ATRA的抗肿瘤作用，如PI3K/AKT和ERK通路［10］、mTOR信号通路［11］、Wnt/β-catenin信号通路［12］等。本研究发现，ATRA可抑制MCF-7细胞的增殖，促进MCF-7细胞凋亡，并伴随有DOK1蛋白的表达增加;沉默DOK1可降低PPARγ的表达和活性;沉默DOK1基因或利用PPARγ选择性抑制剂均可逆转ATRA对MCF-7细胞生存的影响。这些结果证实ATRA抗乳腺癌细胞生长的作用可经DOK1/PPARγ信号通路介导，为ATRA抗肿瘤作用提供了新的机制。

Figure 5.Inhibition of PPARγ attenuated the anti-cancer effect of all-trans retinoic acid ( ATRA) in MCF-7 cells.Mean±SD.n =6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05 vs ATRA group.图5　抑制PPARγ降低全反式维甲酸的抗肿瘤效应

DOK1属于肿瘤抑制基因，其高表达可抑制肿瘤生长。在白血病HL-60细胞中，ATRA可促进DOK1的表达，并由此调节细胞的增殖与分化［13］。我们的结果与其一致，ATRA同样可以增加乳腺癌MCF-7细胞DOK1的表达，起到抑制乳腺癌细胞增殖、促进其凋亡的作用。而且，我们还发现，DOK1通过调节PPARγ而调节肿瘤细胞的增殖和凋亡。

PPARγ属于激素核受体超家族成员，具有调节葡萄糖与脂质代谢、免疫调节、细胞生长与分化等作用，在胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病、肿瘤的发生发展中具有重要作用。新近研究表明: PPARγ表达在包括乳腺癌在内的多种肿瘤细胞中。尽管PPARγ肿瘤抑制作用的机理并不清楚，大量证据表明PPARγ激动剂可通过激活PPARγ，有效促进肿瘤细胞的生长停滞、凋亡以及分化，为肿瘤的治疗提供一个新的靶点［14］。本研究的结果表明，DOK1的高表达可激活PPARγ，而PPARγ抑制剂可逆转ATRA的抗肿瘤作用，表明PPARγ介导了ATRA的作用。

需要回答的问题是DOK1如何激活PPARγ。DOK1的主要功能是通过与p120-RasGAP蛋白的结合抑制PI3K/AKT和Ras-Raf-MEK-ERK信号通路［8］。研究表明，ERK信号通路与PPARγ具有广泛的联系，可相互影响，其具体的作用形式和方法依赖于细胞的类型。在缺乏DOK1的小鼠胚胎成纤维细胞( MEF细胞)中，ERK的活性和PPARγ在Ser112位点的磷酸化均明显增加;相反，恢复DOK1的表达可导致ERK活性和PPARγ在Ser112位点磷酸化的降低;而且DOK1对PPARγ在Ser112位点磷酸化的影响可被ERK特异性抑制剂逆转［15］。由于PPARγ 在Ser112位点磷酸化的程度与其活性呈相反关系，即该位点磷酸化的增加表明其活性降低，因此，DOK1的缺乏将降低PPARγ的活性［15］。这一结论与本实验的结果完全一致，沉默DOK1的MCF-7细胞可导致PPARγ蛋白含量的降低、PPARγ在Ser112位点的磷酸化增加以及PPARγ转录活性的降低(图4)。因此，DOK1可通过对ERK的抑制作用，降低PPARγ在Ser112位点磷酸化，提高PPARγ的活性，并借此影响肿瘤细胞的增殖与凋亡。

总之，本研究结果表明，ATRA通过诱导DOK1表达，并由此增强PPARγ活性而调节乳腺癌细胞的增殖和凋亡，该研究结果加深了对ATRA治疗乳腺癌作用机理的认识，为其抗乳腺癌治疗提供了新的理论解释。

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All-trans retinoic acid suppresses proliferation of breast cancer cells through DOK1/PPARγ pathway

LIU Hua1，CHEN Hao1，TANG Zhao2，ZHANG Ye-min2，LI Ming-xin2，WANG Changhua2
(1Department of Pathology，The First People’s Hospital of Lianyungang，Lianyungang 222002，China;2Department of Pathophysiology，Wuhan University School of Basic Medical Sciences，Wuhan 430071，China.E-mail: chwang0525@ whu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the potential effect of all-trans retinoic acid ( ATRA) on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells and its underlying mechanism.METHODS: Human breast cancer MCF-7 cells were incubated in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin.Western blot was performed to detect the protein expression and its phosphorylation.MTT assay and bromodeoxyuridine ( BrdU) incorporation，and TUNEL staining were carried out to determine the cell proliferation and apoptosis，respectively.Lentivirus carrying shRNA sequences targeting the gene of docking protein 1 ( DOK1) was used to silence DOK1 expression.The activity of peroxisome proliferator-activated receptor gamma ( PPARγ) was measured using a PPARγ transcription factor assay kit.RESULTS: ATRA treatment suppressed the proliferation and promoted the apoptosis of MCF-7 cells.ATRA was also found to induce DOK1 expression in a time-dependent manner.Silence of DOK1 mitigated anti-cancer effect of ATRA evidenced by recovered the cell proliferation and reduced the cell apoptosis.In addition，DOK1 knockdown inhibited PPARγ expression and activity.Furthermore，inhibition of PPARγ with its specific inhibitor GW9662 attenuated impacts of ATRA on the cell proliferation and apoptosis.CONCLUSION: ATRA suppresses MCF-7 cell survival through inhibiting cell proliferation and promoting cell apoptosis，which is mediated by DOK1-activated PPARγ.

［KEY WORDS］All-trans retinoic acid; Cell proliferation; Apoptosis; Docking protein 1; MCF-7 cells

通讯作者△Tel: 027-68759846; E-mail: chwang0525@ whu.edu.cn

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目( No.30770758/H0178)

［收稿日期］2015-01-08［修回日期］2015-03-20

［文章编号］1000-4718( 2015)07-1178-06

［中图分类号］R363

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.005