Identifiler与Identifiler Plus扩增试剂盒检验结果的比较

泉州市公安局 焦 志

1 材料和方法

1.1 样本

棉签血斑、泥土上的血斑、绿色叶子上血斑、深色布料上血斑、低模板DNA降解检材样本均来自日常案件检材。

1.2 仪器设备及试剂

（1）主要试剂：Identifiler、Identifiler Plus扩增试剂盒。

（2）主要仪器：PE9700型DNA扩增仪，ABI3130XL遗传分析。

1.3 DNA的提取

分别剪取适量棉签上血斑、绿色叶子上血斑、泥土上的血斑、深色布料上血斑放入0.5ml离心管中，加入300μL 5%Chelex-100，56℃孵育 1h，99℃变性 8min，13000rpm 离心3min，取 0.5μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL 上述检材样本分别用Identifiler、Identifiler Plus扩增试剂盒做梯度扩增，电泳结果做比较。4份低模板量DNA样本采用M48核酸纯化法提取，各取1μL模板DNA分别用Identifiler、Identifiler Plus扩增试剂盒进行29cycles、32cycles扩增，电泳结果做比较分析。棉签上的血斑用于比较Identifiler Plus与Identifiler扩增试剂盒对血红素的抗抑制作用，因此血斑剪取较大取5mm×5mm面积。绿色叶子上血斑、泥土上的血斑、深色布料上血斑用于比较Identifiler Plus与Identifiler扩增试剂盒对多糖、多酚，腐殖酸、染料的抗抑制作用，因此血斑取3mm×3mm面积，而载体部分多剪取3mm×3mm面积。

1.4 PCR扩增

按照Identifiler Plus扩增试剂盒与Identifiler扩增试剂盒的操作手册进行， PCR反应体系总体积为10μL。

1.5 STR分型检测

PCR扩增产物采用毛细管电泳进行分析，在ABI3130XL遗传分析仪上完成。

2 结果和讨论

法医检验 DNA样本大多来自于犯罪现场，由于环境的复杂多变，很多检材都含有各种污染物、杂质。这些物质或多或少会对下游的PCR反应产生抑制，导致扩增的不平衡，等位基因的丢失，甚至使整个扩增过程失败。血斑中的血红素、土壤中的腐殖酸、绿色叶子中的多糖、多酚，深色布料中的染料[1]，这些因素都会对扩增反应产生明显的抑制作用，从而使后续的PCR反应部分或者完全失败。图1为棉签血斑模板DNA梯度扩增后电泳结果，5%Chelex-100孵育变性后的溶液呈深红褐色，溶液中存在大量的血红素，血红素中的铁离子能够竞争性的干扰镁离子与Tag酶的结合影响PCR反应。图中表明，当加入2μL模板DNA时，ID扩增后电泳结果有一半基因座未能检出，而IDPlus在加入5μL模板DNA时，15个基因座全部得出完整分型。图2为泥土上的血斑模板DNA梯度扩增后电泳结果，5%Chelex-100孵育变性后的溶液呈黄褐色，土壤中含有大量的腐殖酸，而腐殖酸在比较低的浓度就可以与模板DNA、Tag酶发生相互作用影响扩增反应。图中表明，当加入2μL模板DNA时，ID扩增后电泳结果只有少数几个基因座检出，而 IDPlus在加入 5μL模板DNA时，15个基因座全部得出完整分型。图3为深色布料上血斑模板DNA梯度扩增后电泳结果，5%Chelex-100孵育变性后的溶液呈深蓝色，溶液中存在大量的蓝色染料。染料可以竞争性的干扰引物结合位点以及抑制Tag酶活性。图中表明，当加入2μL模板DNA时，ID扩增后电泳结果有一多半基因座未能检出，而IDPlus在加入5μL模板DNA时，15个基因座全部得出完整分型。

图1 血斑中的血红素对ID、IDplus扩增的影响

图2 泥土中的腐植酸对ID、IDplus扩增的影响

图3 深色布料中染料对ID、IDplus扩增的影响

图4 植物中多糖、多酚对ID、IDplus扩增的影响

图4为绿色叶子上血斑模板DNA梯度扩增后电泳结果，5%Chelex-100孵育变性后的溶液呈绿色，植物中含有大量多糖、多酚、胶质、木聚糖等物质，这些物质能够协同抑制PCR。图中表明，当加入3μL模板DNA时，ID扩增后电泳结果只有少数几个基因座检出，而IDPlus在加入5μL模板DNA时，15个基因座全部得出完整分型。实验结果表明Identifiler Plus与Identifiler扩增试剂盒相比对血红素、多糖、多酚、胶质、木聚糖、腐殖酸、染料等具有更强的抗抑制作用。由于Identifiler Plus扩增试剂盒对buffer进行了改进，加入了增强剂及抗抑制剂成分[2]，一些增强剂的加入比如 Tween20、二甲基亚砜、聚乙二醇等可以抵制 PCR抑制剂的作用。Identifiler Plus引物的合成工艺也进行了改善，而且采用了催化活性更强的聚合酶，所以Identifiler Plus与Identifiler扩增试剂盒相比可以耐受更强浓度的各种PCR抗抑制物。从电泳结果中还可以看到Identifiler Plus扩增后等位基因的峰高、峰的面积也要大于Identifiler。表1结果为4份低模板降解DNA样本分别用 Identifiler、Identifiler Plus扩增试剂盒进行29cycles、32cycles扩增后电泳结果，可以看出在29cycles，3个样本使用Identifiler、Identifiler Plus扩增后都只得到了部分基因座分型，而 Identifiler Plus等位基因的丢失要好于Identifiler。另外 1 个样本 29cycles下 Identifiler、Identifiler Plus都没有检出基因座分型。当把循环数加到32个时，Identifiler Plus与Identifiler相比，4个样本都得到了更多的基因座分型，而同样Identifiler Plus等位基因的丢失要好于Identifiler。结果表明对于低模板降解DNA样本Identifiler Plus能够检出更多的等位基因分型，更少的等位基因丢失。综上所述，Identifiler Plus扩增试剂盒与Identifiler扩增试剂盒相比具有更好的抗PCR抑制物作用、对于降解DNA低模板DNA样本具有更高的灵敏度。

表1 ID、IDplus分别扩增29、32个循环电泳结果比较

[1] 郑秀芬.法医DNA分析[M]. 北京: 中国人民公安大学出版社, 2002.

[2] Deneis Y. Wang, Chien-WeiChang, Robet E,Lagace, et al. Developmental validation of the amp FLSTRRIdentifiler plusRPCR amplification kit: An established multiplex assay with improved performance[J]. J Forensic Sci,2012, 57(2): 453-465