救脑益智方剂水提液对人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞的保护作用

张景燕，张静爽，曹子青，赵志炜，张 旭，吴燕川，王玉兰，王 蓉

（1.首都医科大学宣武医院中心实验室，北京脑重大疾病研究院阿尔茨海默病研究所，神经变性病教育部重点实验室，北京 100053；2.北京京师中医医院，北京 100026）

救脑益智方剂水提液对人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞的保护作用

张景燕1，张静爽1，曹子青2，赵志炜1，张 旭1，吴燕川1，王玉兰1，王 蓉1

（1.首都医科大学宣武医院中心实验室，北京脑重大疾病研究院阿尔茨海默病研究所，神经变性病教育部重点实验室，北京 100053；2.北京京师中医医院，北京 100026）

目的通过观察复方中药救脑益智方剂水提液对人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞生长以及胰岛素信号通路的影响，探讨其对神经细胞保护作用的机制。方法 体外培养SH-SY5Y细胞，分为对照组（C组）、救脑益智1号方组和3号方组，每组药物剂量分别为0.0625 mg/mL、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL和1 mg/mL，测定各组细胞的噻唑蓝（MTT）代谢率，选定0.125 mg/mL进行细胞免疫荧光染色，观察细胞形态和胰岛素受体底物-1（IRS-1）、cAMP反应元件结合蛋白（CREB）表达的变化。结果 与对照组相比，救脑益智组MTT代谢率升高（P＜0.05），细胞形态好，表现为细胞胞体饱满、贴壁良好、突起延长，IRS-1和CREB表达增加。结论 复方中药救脑益智水提液能促进神经细胞生长，提高神经元胰岛素信号通路相关因子IRS-1和CREB表达，推测其神经保护作用机制与胰岛素信号通路有关。

阿尔茨海默病；复方中药，救脑益智方剂；人神经母细胞瘤株SH-SY5Y

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD，又称老年性痴呆）是以认知功能障碍为主要表现的、渐进性加重的神经系统变性病，临床上80％以上的患者属于病因不清、发病机制不明的散发性AD，由于缺乏有效的早期诊断和治疗措施，AD已经成为继心脑血管疾病和恶性肿瘤之后威胁人类健康的第四大杀手［1-3］。AD的发病机制十分复杂，近年来，脑内神经元胰岛素信号通路障碍在AD发生发展中的作用越来越引起学者们的关注［4-6］。

救脑益智胶囊的主要成分有生黄芪、党参、白术、龟甲、穿山甲、肉苁蓉等，具有益气养血、滋补肝肾、化痰祛痕、健脑益智功效，在临床上对一些脑萎缩病人有较好的治疗作用［7］。以往研究发现救脑益智胶囊能促进神经元胞体增大和突起延长［8］，并能促进SY5Y神经母细胞存活信号通路中Akt/PKB，P-CREB的表达［9］。本研究拟通过观察救脑益智胶囊的改良配方（1号方和3号方）方剂水提液对人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞生长以及胰岛素信号通路的影响，探讨其对神经细胞保护作用的机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株：人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞来自瑞典卡罗琳斯卡医学院。

1.1.2 药品与试剂：救脑益智水提液由救脑益智胶囊制成（胶囊主要成分包括黄芪、党参、肉苁蓉、龟板、当归、白芍等20余味中草药，形态为粉剂，使用前用电子天平称重，然后加蒸馏水煮沸15 min，离心取出上清液，再向沉淀物中加入蒸馏水煮沸15 min，离心取上清液，将两次取出的上清液混合，浓度调整为1 g生药/3 mL，即若蒸馏100 g生药将得到300 mL水提 液）。MTT（噻 唑 蓝，3-［4，5-dimethylthylthiazol-2-yl］-2，5diphenyltetrazolium broide）系Sigma产品。二甲基亚砜（DMSO）系北京亚太精细化工公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：使用含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，3 d换液1次，6 d传代1次。

1.2.2 测定MTT代谢率：将生长状态良好、传代稳定的SH-SY5Y细胞以1×104/mL的密度接种于96孔板（Nunc产品）中，每孔各加200 μL，培养48 h后分为3组：对照组、救脑益智1号方组（主要成分包括黄芪、党参、补骨脂等）和3号方组（主要成分包括人参、益智仁、鹿角等），进行后续实验。各药物组所加相应药物的浓度分别为 0.0625 mg/mL、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL和1 mg/mL，各组培养液体积和接种细胞数相等。继续培养24 h后加MTT溶液（5 mg/mL）20 μL/孔，于37℃孵育4 h后吸出培养液，再加DMSO溶液200 μL/孔，振摇 10min后用全波长酶标仪（Multiskan Spectrum）测定550 nm处吸光度值（A）。

1.2.3 细胞免疫荧光染色：将SH-SY5Y细胞以1× 104/mL的密度接种于24孔板中，每孔各加1 mL，于培养箱中培养48 h后分为以上3组进行后续实验，根据MTT结果选用0.125 mg/mL药物剂量作用细胞24 h，然后吸弃培养液，用PBS漂洗1次，加入4％多聚甲醛固定30 min，10％山羊血清封闭1 h，加入一抗（IRS-1抗体、CREB抗体，1：100）于4℃孵育过夜，用PBS漂洗后加相应二抗（1：200）孵育1 h，PBS漂洗后于荧光倒置显微镜下观察并采集影像。

1.3 统计学方法

使用SPSS 17.0软件进行统计，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT代谢率测定

MTT检测结果显示，救脑益智1号方组和3号方组的SH-SY5Y细胞MTT代谢率升高，线粒体活性增强，与对照组相比，P＜0.05，差异有统计学意义（表1）。

表1 救脑益智1号方组和3号方组对SH-SY5Y细胞MTT代谢率的影响Tab.1 Effect of Jiu Nao Yi Zhi No.1 or No.3 prescription on the metabolic rate in SH-SY5Y cells

2.2 细胞免疫荧光染色

从细胞形态上看，救脑益智1号方和3号方的细胞形态相对好，细胞胞体饱满、贴壁良好、突起延长；另外，与对照组相比，1号方和3号方的细胞中IRS-1和CREB表达增加。各组SH-SY5Y细胞的形态及CREB、IRS-1的表达情况分别见图1、图2（图1，2见文后彩插5）。

3 讨论

救脑益智胶囊的主要成分有生黄芪、党参、白术、肉苁蓉等，具有益气养血、滋补肝肾、化痰祛痕、健脑益智功效，可用于气血肝肾亏虚、痰疲阻滞引起的健忘不寐，神情呆滞，眩晕耳鸣，言语蹇涩，肢体痪软，步履艰难等症候者［7］。我们曾经研究发现，救脑益智提取液能促进体外培养的人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）生长，推测其机理可能与其促进神经元信号通路中有关蛋白质的表达有关［9］，此后我们一直在研究与之相关的蛋白质及其作用途径。

本研究结果表明，救脑益智水提液能促进SHSY5Y细胞胞体体积的增大和突起的延长，并能提高MTT代谢率。MTT是琥珀酸脱氢酶的作用底物，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使其还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO溶解细胞中的甲瓒，用全波长酶标仪在550 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。MTT值越大，代表活细胞数目越多。

众所周知，神经元可通过多条途径使自身存活，而IRS-PI3K/Akt-BAD-CREB途径即是其主要途径之一，IRS磷酸化后激活PI3K/Akt，最终使CREB磷酸化，从而使神经元存活。本室以往的研究结果表明救脑益智胶囊水提液能提高使SH-SY5Y细胞存活的PI3K信号通路中Akt和p-CREB的表达水平，而Akt表达增加可促进CREB磷酸化增加，即与本室得出的研究结果p-CREB表达增加一致，而SY5Y细胞的存活一方面依赖于p-CREB表达水平的提高［9］。本研究结果表明，救脑益智方剂水提液也可使IRS-1、CREB表达增加，由此可以推断救脑益智方剂水提液中含有某些神经营养成分，而且可以通过影响胰岛素信号通路中蛋白的表达水平，而发挥保护神经细胞并促进其生长的作用。但是体外实验有效不等同于药物在体内也有效，因此仍需进行充分的体内试验。

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［9］孟艳，张景燕，王蓉，等.救脑益智胶囊水提物对人神经母细胞瘤株SY5Y信号转导的影响［J］.中国中药杂志，2003，28（11）：1076-1077.

Protective effect of the traditional Chinese medicine prescription，Jiu Nao Yi Zhi water extract，on human neuroblastoma SH-SY5Y cell line

ZHANG Jing-yan1，ZHANG Jing-shuang1，CAO Zi-qing2，ZHAO Zhi-wei1，ZHANG Xu1，WU Yan-chuan，1WANG Yu-lan1，WANG Rong1
（1.Central Laboratory，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Key Laboratory for Neurodegenerative Diseases of Ministry of Education，Center of Alzheimer’s Disease，Beijing Institute for Brain Disorders，Beijing 100053，China；2.Beijing Municipal Chinese Medicine Hospital，Beijing 100026，China）

Objective To observe the protective effect of the traditional Chinese medicine prescription，Jiu Nao Yi Zhi water extract，on human neuroblastoma SH-SY5Y cell line，its effect on expression of insulin signal transduction pathway，and to explore the related mechanisms.Methods SH-SY5Y cells cultured in vitro，were divided into control group，Jiu Nao Yi Zhi No.1 prescription group and No.3 prescription group.The doses were 0.0625 mg/mL，0.125 mg/mL，0.25 mg/mL，0.5 mg/mL and 1 mg/mL.The thiazolyl blue（MTT）metabolic rate of each group was determined.The dose of 0.125 mg/mL was chosen for cell immunofluorescence analysis，and to observe the expression of insulin receptor substrates-1（IRS-1），cAMP response element binding protein（CREB），and the factors of insulin signal transduction pathway.Results Compared with the control group，MTT metabolic rates of the Jiu Nao Yi Zhi groups were significantly increased（P＜0.05），and the cell morphology was much better in those groups，cell body more plump，welladherent and neurite extensions were observed.The expressions of IRS-1 and CREB were higher than that in the control group.Conclusions The traditional Chinese medicine prescription Jiu Nao Yi Zhi water extract can protect neurons by promoting nerve cell growth，and improving the expression of IRS-1 and CREB，the factors of insulin signal transduction pathway.

Alzheimer’s disease；Traditional Chinese medicine prescription，Jiu Nao Yi Zhi；Human neuroblastoma，cell line SH-SY5Y；Neuroprotection

R33

A

1671-7856（2015）04-0058-03

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.011

北京市自然科学基金（7132044）；首都卫生发展科研专项项目（2011-1001-02）；北京市卫生系统高层次卫生技术人才计划资助项目（2009-3-64）。

张景燕，女，主管技师，研究方向：细胞生物学，E-mail：908436005@qq.com。

王蓉，女，研究员，博士研究生导师，研究方向：神经元退行性变的发生机制和防治策略。E-mail：rong_wang72@aliyun.com。

2015-02-10