海藻酸钠包埋啤酒酵母絮凝剂的制备研究

张龙颜，李保珍，李丹，张晓峰，王兰＊

（1.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西省煤炭地质局，山西 太原 030006）

0 引言

山西拥有丰富的地下岩溶水资源，但是矿化度和硬度很高。经测定，太原市清徐县地下岩溶水的矿化度和硬度（以CaCO3计）分别高达3 109 mg·L－1、2 856 mg·L－1，属于高矿化度和高硬度水，不能直接作为工农业生产用水和生活饮用水［1］。常规化学絮凝剂在使用过程中会对水质带来一定危害，例如化学絮凝剂聚合氯化铝中的铝离子对环境危害主要包括：毒害水生生物和微生物，通过食物链和饮用水最终危害人体健康［2］。近年来，微生物作为一种新型的絮凝剂备受关注。研究发现，利用微生物进行水处理具有良好的效果，体现出活性高、用量少、无二次污染等优点［3－6］。

微生物处理污水和废水的原理是，运用微生物菌体或其产生的代谢物对水体中的污染有机物、固体悬浮颗粒、菌体细胞及胶体粒子等发生凝聚、沉淀［7］。郭彦涵［8］发现用啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）制作的固定化菌可以处理高矿化度和高硬度水，即利用固定化剂海藻酸钠包埋啤酒酵母制作的固定化小球，较单独添加啤酒酵母或海藻酸钠空白球处理效果更好；其发现固定化小球在投加量4g·L－1、絮凝时间60 min时，对岩溶水中离子吸附效果最大；分析水样后发现，啤酒酵母固定化小球对岩溶水中的离子尤其是Ca2＋、Mg2＋具有很强的吸附性能，能够降低岩溶水的硬度和矿化度。但是，关于固定化因素对小球物理性质及对硬度矿化度处理效率的影响少见报道。

本研究从制作固定化小球的固定化因素出发，选出具有最优物理性质的固定化区间，再以选出的最优物理性能的固定化因素为水平区间，以岩溶水的硬度和矿化度处理效率为指标进行正交实验，探讨固定化因素对岩溶水硬度和矿化度絮凝效果的影响，研制出固定化小球的最优固定化条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

海藻酸钠（优级纯，天津光复精细化工研究所）；氯化钙（分析纯，天津市巨星圣源化学试剂有限公司）；钙和镁标准液：购自国家标准样品研究所；

1.1.2 主要仪器

火焰原子吸收仪（美国瓦里安公司，AA240FS）、雷磁便携式电导率仪（上海化学精密科学仪器有限公司，DDB-303A）、空气恒温摇床（美国 GXROMAX，SK-767）、医用高速离心机（北京医用离心机厂）、磁力搅拌器（双向磁力加热搅拌器，78-2型）、扫描电子显微镜（日本，JSM-6360LV）、冷冻干燥机（上海比朗仪器制造有限公司，FD-1A-50）

1.1.3 实验菌种

啤酒酵母（取自山西大学生命科学学院微生物实验室），所需培养基如下：种子培养基：马铃薯20 g，葡萄糖2 g，蒸馏水100 m L；121℃灭菌30 min［9］。扩大培养基：葡萄糖2 g，麦芽糖3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，酵母粉10 g，牛肉膏5 g，蒸馏水1 000 m L；121℃灭菌30 min［10］。培养方法：取一环保藏的啤酒酵母菌种接种到种子培养基上，恒温摇床110 r·min－1、28℃培养3 d，再以3% 的接种量接种到扩大培养基上。在110 r·min－1、28℃条件下进行扩大培养3 d后［11］，取啤酒酵母菌液在离心机上以4 000 r·min－1、10 min离心得到菌体之后，用无菌蒸馏水冲洗菌体再次离心。重复3次后得到菌体备用。

1.1.4 水样

岩溶水（采自太原市清徐县北营村井下700 m处），经原子吸收仪测定水样离子含量后，计算出开采出来的水样总硬度（以CaCO3计）达到2 856 mg·L－1，矿化度（经电导率仪测定后经公式换算）达3 109 mg·L－1，属于高矿化度高硬度水。

1.2 方法

1.2.1 啤酒酵母絮凝剂的制备流程

絮凝剂的制备流程如下：① 称取一定质量的海藻酸钠溶于水中，配成质量分数2%的海藻酸钠溶液；②取一定质量的啤酒酵母加入到质量分数为2% 海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后配成菌体占总质量分数为8%的混合液；③ 用10 m L注射器取混合液滴入到预先配好的质量分数2% 的氯化钙溶液中交联成球，4℃ 冰箱静置6 h，抽滤、洗涤后放入保藏培养基中备用［6，12］。

1.2.2 啤酒酵母包埋菌的驯化培养

配置保藏驯化培养基，保藏驯化培养基成分为：葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、p H自然，保藏培养基所用水为岩溶水。其中将制备好的固定化啤酒酵母以一定的质量比例加到装有保藏培养基的250 m L三角锥瓶中，在空气恒温摇床上以110 r·min－1、28℃ 条件培养驯化3 d，期间保藏培养基每天一换。

1.2.3 啤酒酵母包埋菌絮凝岩溶水的分析方法

取上述制作驯化了的固定化啤酒酵母0.8 g投入到200 mL岩溶水中，在磁力搅拌器上（以750 r·min－1转速）常温处理60 min，之后取样过滤，稀释，测钙、镁离子含量及电导率，并计算硬度和矿化度及絮凝率［15－17］。

1.3 固定化因素对啤酒酵母絮凝剂物理性能的影响

1.3.1 海藻酸钠浓度、菌体质量比、交联时间及氯化钙浓度对固定化小球物理性能的作用

在其他条件不变的情况下，相应的海藻酸钠质量分数分别为1.0%－4.0%、菌体质量比分别为4%、6%、8%、10%、12%，交联时间4 h、6 h、8 h、12 h、24 h以及氯化钙浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%。制作方法与1.2.1的方法相同，选取一定量的小球过滤、抽滤、洗涤测其成球性能、机械强度和渗透性能。成球效果：肉眼观察；机械强度测定：取制作好的10粒大小一样的固定化小球放在两个干净的载玻片之间，用滤纸吸干小球水分，用载玻片缓慢压小球，以小球破碎瞬间的电子天平指示的数值作为小球（换算成10－2N）机械能力指标，连测3次取平均值［13］；渗透性能测试：选取形态完好、大小均匀的固定化小球，浸入惰性红墨水中，记录小球被红墨水完全渗透的时间［14］。

1.3.2 用正交实验优化制作啤酒酵母固定化小球的固定化因素

以SA浓度、菌体质量比、交联时间和氯化钙浓度为正交实验因素，分别记作A、B、C、D，以单因素最优物理性质为水平区间，以硬度、矿化度絮凝率为指标，通过正交实验选出最优固定化条件。

1.4 硬度和矿化度及絮凝率分析方法

总硬度测定方法用文献［18-19］的方法，先用火焰原子吸收仪测定水样中钙和镁离子的浓度，后用如下公式（1）计算总硬度，其中，TH 为总硬度，［Ca2＋］为 Ca2＋浓度（mg·L－1），［Mg2＋］为 Mg2＋浓度（mg·L－1），总硬度（TH）以CaCO3计，计算每升岩溶水中钙镁离子的总物质的量（mmol），并与系数100.08相乘得到每L岩溶水中所含CaCO3的质量（mg）即为总硬度。硬度絮凝率的计算如式（2）所示，其中R为絮凝率，C0为原岩溶水的硬度，C为经絮凝剂处理后岩溶水的硬度。

矿化度的测定参照公式（3）时红［20］的方法，其中，y为矿化度（mg·L－1），x为电导率（mS·cm－1），先用电导率仪测定水样中的电导率，再通过公式（3）计算矿化度，并计算絮凝率，絮凝率的计算如式（2）。

2 结果

2.1 包埋菌形态及表面微观结构

新制备的包埋菌小球（如图1a）为直径约1～2 mm的规则小球，其中小球凝胶部分为白色呈半透明状，整体颜色因包埋活性啤酒酵母而成肉眼可见的乳白色，小球表面光滑且有弹性，机械强度良好，无异味。将固定化小球冷冻干燥后、喷金、在扫描电子显微镜下观察（图1b、c、d），可以发现固定化小球表面凹凸不平并有大量凸起，分别放大300和1 000倍后，发现固定化小球表面附着着大量的啤酒酵母菌，海藻酸钠跟氯化钙的交联能够为啤酒酵母提供良好的生存环境；在凸起处有许多球形突起，说明啤酒酵母与包埋凝胶体表面结合紧密。而菌团状的啤酒酵母则增强了其对金属离子的集中絮凝能力；菌越集中，则受到水的冲刷力就越小。在包埋菌驯化絮凝岩溶水后发现，小球表面变化较大（图1e），其中小球表面附着大量的似菌体代谢产物的絮状物，小球表面多出许多孔隙和空洞，能够为与金属离子结合提供条件，而菌代谢产物蛋白质、核酸上的活性基团能够与金属离子络合并形成络合物并附着在小球表面。

Fig.1 Shape and SEM pictures of immobilization pellets图1 固定化小球形态与表面微观结构

2.2 海藻酸钠浓度对固定化小球物理性能的影响

表1 海藻酸钠浓度对固定化效果的影响Table 1 Effect of sodium alginate concentration on immobilization effect

从表1可以看出，随着SA浓度的增大，固定化小球机械强度逐渐增强，渗透时间逐渐增加。当SA溶液浓度在1.0%－1.5%时，固定化小球不成球或者成球形状不规则。渗透时间短表明红墨水传质性能良好；机械强度低使得抗压力差、容易破碎，导致不能重复利用。当SA溶液在2.0%－3.0% 时，固定化小球成球形状规则、有弹性，渗透时间较短、传质性能良好；机械强度随着SA溶液浓度的增加而增加，增加重复利用性。然而，当SA溶液浓度高于3.0%时，固定化小球成球有严重的拖尾现象，机械强度虽然大但是传质性能不理想，不利于菌体发挥其活性。故选用2.0%－3.0% 浓度的SA作为包埋剂包埋菌体。

2.3 菌体包埋比、交联时间与氯化钙浓度对固定化小球物理性能的影响

依据海藻酸钠浓度对固定化菌物理性质的实验分析方法，同理可得，当啤酒酵母菌体与SA质量比例为6%－10%时，固定化小球成球规则，机械强度好，达到32.61×10－2N以上，传质性能好。交联时间是指菌体－SA混合液滴入交联剂氯化钙溶液后的成球反应时间，由实验结果可知，当交联时间为6～10 h时，其小球成球规则，机械强度高、传质性能良好。同理，应选用2%－4% 氯化钙作为其最佳包埋交联剂浓度。

2.4 正交实验因素与结果

本实验采用正交表L9（34）进行试验，即四因素三水平，共有9组实验组，每组三次重复。以海藻酸钠、菌体质量比、氯化钙和交联时间为因素，以单因素物理性质实验选出的最优水平为正交实验水平，分别以硬度和矿化度絮凝率为试验指标。正交试验因素及水平如下表2所示，正交试验结果及方差分析如表3、表4、表5、表6所示，其中矿化度絮凝率结果及方差分析如表3、表4所示，硬度絮凝率结果及方差分析如表5、表6所示。

表2 正交试验因素及水平Table 2 Factors and levels of orthogonal array design

表3 矿化度正交试验结果Table 3 Orthogonal results of salinity

表3是以矿化度絮凝率为指标计算出的各因素条件下的实验结果之和与极差，分别用k1、k2、k3表示，极差用R表示，k越大表示条件越优，从表可以看出：比较k1、k2、k3的大小可以得出，A2B3C3D3为各个因素的最佳水平组合，分析极差R大小可以得出各因素对矿化度絮凝率影响顺序为：B（菌体质量比）＞D（交联时间）＞A（SA浓度）＞C（氯化钙浓度）。当P＜0.01时，表明该因素对实验结果影响极显著；当0.01＜P＜0.05时，表明该因素对实验结果影响为显著；而P＞0.05为不显著。由表4方差分析结果可知，菌体质量比对絮凝剂矿化度絮凝率影响呈极显著；交联时间影响显著；而SA浓度和氯化钙浓度则影响不显著，比较P值和F值大小可得絮凝剂对矿化度絮凝率影响大小顺序为：菌体质量比＞交联时间＞SA浓度＞氯化钙浓度，与直观极差分析相吻合。综合来看，对矿化度絮凝率最优的絮凝剂的制作条件为：3%SA浓度、10%的菌体质量比、4%的氯化钙浓度和10h的交联时间。絮凝剂对矿化度絮凝率影响大小顺序为：菌体质量比＞交联时间＞SA浓度＞氯化钙浓度。

表4 矿化度方差分析Table 4 Anova for salinity

表5 硬度正交试验结果Table 5 Orthogonal results of hardness

表6 硬度方差分析Table 6 Anova for hardness

由表5同理可知，比较k值大小可以得出，A1B2C1D3为各个因素的最佳水平组合，即2%的SA浓度、8%的菌体质量比例、2%的氯化钙浓度和10 h的交联时间。比较极差R大小可知各因素对矿化度絮凝率影响顺序为：A（SA浓度）＞B（菌体质量比）＞D（交联时间）＞C（氯化钙浓度）。由表6可知：氯化钙浓度对絮凝剂硬度絮凝率影响不显著，其余因素都呈极显著，比较P值和F值大小可得絮凝剂对硬度絮凝率影响大小顺序为：SA浓度＞菌体质量比＞交联时间＞氯化钙浓度。

对硬度絮凝率较好的最优组合为：A1B2C1D3；而矿化度最优组合为：A2B3C3D3，故对因素A（SA浓度）来说，可以选取A1A2二种情况。但是从极差与方差分析来看，A因素对硬度絮凝率影响较大，结合成本来考虑，应选A1即2.0%的海藻酸钠。对于因素B来说，可取B2B3，但由于因素B对矿化度絮凝率影响较大，即选择B310% 的菌体海藻酸钠质量比作为最佳包埋比例。因素C对硬度矿化度影响都比较小，可得C1或者C3即2%、4% 的氯化钙浓度都可以作为其最佳交联剂浓度。结合处理率考虑，选择C3即4%作为最佳氯化钙浓度；同理可得交联时间D3即10 h为其最佳交联时间。综合考虑各因素确定固定化小球最佳制作方案为：A1B3C3D3，即2.0% 的海藻酸钠浓度、10% 的菌体包埋比、4.0% 氯化钙和10 h的交联时间，并且硬度矿化度处理率分别达到76.97% 和59.77%，矿化度从3 109 mg·L－1降到1 258 mg·L－1，硬度从2 856 mg·L－1降到了658 mg·L－1。

2.5 固定化啤酒酵母絮凝岩溶水的机理初探

一般情况下，微生物絮凝重金属离子有以下几种情况：胞外富集，表面吸附或者络合，胞内富集。其中，表面的吸附和络合对死、活微生物都存在，而胞外和胞内的大量富集则往往要求微生物具有活性［21］。在一个絮凝体系中，可能会存在上述一种或几种过程。本实验中啤酒酵母对岩溶水进行絮凝，其特点有搅拌快速、处理时间较短、絮凝率高，而一般微生物的胞内或胞外富集则用时较长且絮凝率低，表明主要发挥作用的是菌体表面吸附或络合。根据郭彦涵对啤酒酵母絮凝剂的研究，本实验所用的啤酒酵母包埋菌在处理岩溶水时还应该包括固定化剂（即高聚合化合物）对金属离子吸附作用，而高聚合化合物对金属离子的吸附作用主要是螯合架桥作用。因此，啤酒酵母固定化菌是在双重作用下表现出良好的絮凝效果。

3 讨论

合适的微生物固定化小球必须具备包埋操作简单、成本低、对微生物无害、固定化细胞密度大、机械强度大、机制通透性和传质性能好以及较好的物理强度和化学稳定性等特点［22］。在本实验发现，选择海藻酸钠作为包埋剂、氯化钙作为交联剂，不论从制作难易程度上还是制成球后的机械强度和传质性能上，固定化小球均达到了一定的效果；固定化小球的传质性能随着的机械强度的增大而减小，在考虑机械强度的同时，也要考虑传质性能，因为其很可能影响固定化小球吸附性能。综合物理性质考虑，选取制作固定化小球的最优区间为海藻酸钠浓度2.0%－3.0%、菌体包埋比例为6%－10%、交联时间为6～10 h、氯化钙浓度2.0%－4.0%。这也与辛蕴甜、包木太［13－14］等对固定化小球的研究结果相似。

通过正交实验分析我们得出，最佳固定化条件为：2.0% 的海藻酸钠浓度、10% 的菌体包埋比、4.0% 氯化钙和10 h的交联时间，较郭彦涵［11］方法制作的固定化条件分别在菌体包埋比、氯化钙浓度和交联时间上都有所增加，机械强度也具有一定的提高，硬度矿化度处理率分别达到76.97% 和59.77%，分别提高了4.53%和3.68%，矿化度从3 109 mg·L－1降低到1 258 mg·L－1，，达到了《地下水质量标准》（GB／T14848-93）的Ⅳ类用水标准，硬度从2 856 mg·L－1降到了658 mg·L－1，接近《地下水质量标准》（GB／T14848-93）的Ⅳ类用水标准。通过正交实验结果及其方差分析发现，四个因素影响矿化度和硬度处理率的主次顺序并不相同。用极差和方差分析看出，菌体包埋比对硬度矿化度结果影响都比较显著，这也验证了郭彦涵［7］对微生物固定化小球的探究，即微生物固化菌发挥作用是两方面共同作用的结果，一是具有活性的微生物对岩溶水中离子的吸附作用，另一方面固定化包埋剂也对水中的离子具有一定的吸附活性，微生物固定化小球是这两方面因素共同作用的结果，所以两者之间合适的比率必然会影响固定化小球的性能。通过分析我们选择絮凝效果最好的10%的菌体包埋比作为固定化的最佳包埋比，也是机械强度能够达到最好时的包埋比例。从极差分析可以看出，海藻酸钠（SA）浓度对硬度处理率的影响要大于矿化度，所以在微生物固定化小球的制作过程中，如果着重降低硬度可以选择低浓度即SA为2.0% 的浓度，矿化度则偏重选择较高的SA浓度，交联时间对硬度和矿化度影响则都不显著。

4 结论

（1）制作微生物啤酒酵母固定化小球最优物理性能区间为：海藻酸钠质量分数2.0%－3.0%、菌体海藻酸钠质量比6%－8%、交联时间为6～10 h和氯化钙质量分数2.0%－4.0%。

（2）通过正交实验得出，海藻酸钠浓度与菌体包埋比对絮凝剂絮凝率影响较大。以矿化度和硬度为指标可以得出制作固定化小球最优固定化条件分别为：2%的海藻酸钠浓度、10%的菌体包埋比、4%氯化钙浓度和10 h的交联时间，此时岩溶水的硬度矿化度絮凝率分别达到76.97% 和59.77%，岩溶水矿化度从3 109 mg·L－1降到1 258 mg·L－1，达到《地下水质量标准》（GB／T14848-93）的Ⅳ类用水标准；硬度从2 856 mg·L－1降到658 mg·L－1，接近《地下水质量标准》（GB／T14848-93）的Ⅳ类用水标准。

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