HPLC-DAD法测定通贤柚叶中两种活性黄酮的含量

黄友秋,赵雪荔,陈 席,游元元,2,*

(1. 成都医学院药学院,四川成都 610083;2. 四川省高校结构特异性小分子药物研究重点实验室,四川成都 610083)

HPLC-DAD法测定通贤柚叶中两种活性黄酮的含量

黄友秋1,赵雪荔1,陈 席1,游元元1,2,*

(1. 成都医学院药学院,四川成都 610083;2. 四川省高校结构特异性小分子药物研究重点实验室,四川成都 610083)

目的:建立HPLC-DAD测定通贤柚叶中柚皮苷与野漆树苷的方法。方法:色谱柱为Sepax Amethyst C18-H(250×4.60mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱,流速1.0mL/min,检测波长为283nm(柚皮苷),337nm(野漆树苷),柱温25℃,进样量20μL。结果:柚皮苷与野漆树苷色谱峰分离良好。二者分别在0.0653～0.6526mg/mL与0.0350～0.3505mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。平均加样回收率分别为98.68%与98.47%。结论:所建立的含量测定方法可用于通贤柚叶的质量控制。采收季节与叶龄对柚叶中两种黄酮类物质的含量有较明显的影响。

通贤柚叶,高效液相色谱-二级管阵列检测器,柚皮苷,野漆树苷,含量测定

通贤柚为川产地方良种柚。自1929年从福建漳州引种至四川省安岳县通贤镇后,经过多年的培育,逐渐成为当地的特有品种,并多次获得全国柚类质量评比金杯奖。2011年,通贤柚被批准为国家地理标志保护产品。目前安岳县已形成百里通贤柚产业带,2013年全县通贤柚栽种面积为3.4万亩。

为了培养合理的丰产树形、平衡生长与结果的关系并培育优良母枝,通贤柚树每年都需修枝剪叶,由此产生了大量废弃柚叶。《本草纲目》记载柚叶具有行气止痛、解毒消肿之效,主治头风痛、寒湿痹痛、食滞腹痛、乳痈等症。柚叶中含有柚皮苷(naringin)与野漆树苷(rhoifolin)等黄酮类物质。柚皮苷具有抗肿瘤[1-2]、抗炎[3]、抗氧化[4]、降血脂[5-6]、调节血糖[7-8]等活性,而野漆树苷对肝损伤有保护作用,也能调节血糖[9-10]。为了充分利用通贤柚叶的药用价值,本实验对通贤柚叶中柚皮苷与野漆树苷两种活性黄酮类物质进行了含量测定,为通贤柚资源的综合利用提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

DionexU3000型高效液相色谱仪 美国戴安公司;BP1215电子天平 Sartorius公司;Rios纯水器 密理博上海贸易有限公司;AS5150BD-I超声波清洗器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司;Anke TGL-16G离心机 上海安亭科学仪器厂。

柚皮苷对照品 成都曼思特生物科技有限公司;野漆树苷对照品 成都曼思特生物科技有限公司。色谱纯乙腈 美国Sigma-Aldrich;分析纯甲醇、分析纯甲酸 成都市科龙化工试剂厂;水为自制超纯水。

通贤柚叶采集自安岳县通贤柚地理标志产品保护产地范围。洗去表面杂质与灰尘,自然阴干后粉碎,过60目筛备用。样品来源见表1。

表1 样品来源

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的配制 精密称取柚皮苷、野漆树苷对照品适量,分别置10mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,配成浓度分别为1.004mg/mL与1.001mg/mL的对照品贮备液。

分别精确移取柚皮苷、野漆树苷对照品贮备液3.25mL与1.75mL,同置5mL容量瓶中,得到浓度分别为0.6526mg/mL与0.3504mg/mL的混合对照品溶液A。分别精确移取柚皮苷、野漆树苷对照品贮备液2.6mL与1.4mL,同置5mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,得到浓度分别为0.5221mg/mL与0.2803mg/mL的混合对照品溶液B。精确移取混合对照品溶液B 2.5mL,置5mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,得混合对照品溶液C。精确移取混合对照品溶液C 2.5mL,置5mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,得混合对照品溶液D。精确移取混合对照品溶液D 2.5mL,置5mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,得混合对照品溶液E。

1.2.2 供试品溶液的配制 取各通贤柚叶样品细粉约3.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入50%甲醇40mL,浸泡过夜,超声提取30min,补足减失质量。提取液离心(2500r/min)10min,取上清液以0.22μm微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。

1.2.3 色谱条件 色谱柱:Sepax Amethyst C18-H柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脱,乙腈的体积分数配比:0～15min为14%→16%,15～35min为16%→17%,35～45min为17%→19.5%,45～70min为19.5%→23%;流速为1.0mL/min;柚皮苷检测波长为283nm,野漆树苷检测波长为337nm;柱温:25℃;进样量为20μL;采样时间70min。混合对照品和通贤柚叶样品分离的色谱图见图1。

1.2.4 标准曲线及线性范围 分别取混合对照品溶液A、B、C、D、E各20μL进样,记录峰面积。以峰面积(A)对样品浓度(C)进行线性回归,得到2种黄酮化合物的回归方程、相关系数与线性范围。

1.2.5 方法学考察 精密度实验:取14号样品,按1.2.2项下方法制备供试品溶液,按1.2.3项下色谱条件重复进样6次,记录峰面积。

重复性实验:取14号样品共6份,按1.2.2项下方法平行制备供试品溶液,按1.2.3项下色谱条件进样,记录峰面积并计算含量。

稳定性实验:取14号样品供试品溶液,在0、1.5、3、4.5、6、7.5、12、36h分别进样测定,记录峰面积。

回收率实验:精密称取已知含量的14号样品约1.5g,共6份,精密加入含有柚皮苷2.487mg/mL与野漆树苷1.847mg/mL的混合对照品溶液1.45mL,混匀,挥干甲醇液后按1.2.2项下方法平行制备供试品溶液,按1.2.3项下色谱条件进样,记录峰面积。

1.2.6 含量测定 取各通贤柚叶粉末样品,按1.2.2项下方法制备供试品溶液,按1.2.3项下色谱条件进样分析,测定各分析物的峰面积。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

实验采用100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇作为提取溶剂,结果表明以50%甲醇溶液提取时柚皮苷及野漆树苷峰面积最大,故选用50%甲醇作为提取溶剂。此外,考察了超声提取20、30、40、50min的提取效果,结果表明30min超声提取能使化学组分被充分提出。

2.2 检测波长的选择

用二极管阵列检测器(DAD)在实验条件下分析了柚皮苷与野漆树苷对照品色谱峰的紫外光谱,其λmax分别为283、337nm,故选择这两个波长分别作为两个待测成分的检测波长。

2.3 两种待测组分的分离情况

柚皮苷与野漆树苷混合对照品及通贤柚叶样品分离的色谱图见图1,在本实验条件下两种黄酮类物质的色谱峰分离良好。

2.4 线性关系考察结果

柚皮苷与野漆树苷含量测定的回归方程、相关系数与线性范围见表2。

表2 2种黄酮类化合物的回归方程、相关系数与线性范围

2.5 方法学考察结果

精密度实验结果见表3。柚皮苷与野漆树苷峰面积的RSD分别为0.31%与1.34%,表明精密度良好。

表3 精密度实验结果

重复性实验结果见表4。柚皮苷与野漆树苷含量的RSD分别为0.84%与1.70%,表明重复性良好。

表4 重复性实验结果

稳定性实验结果见表5。柚皮苷与野漆树苷峰面积的RSD分别为1.28%与1.90%,表明供试品溶液在36h内稳定。

表5 稳定性实验结果

回收率计算结果见表6。柚皮苷与野漆树苷的平均回收率分别为98.68%与98.47%,RSD分别为2.54%与1.48%。

2.6 样品含量测定结果

以外标法计算23个样品中柚皮苷与野漆树苷的含量,结果见表7。

3 结论与讨论

23个通贤柚叶所含柚皮苷含量为1.56%～5.63%,野漆树苷含量为0.66%～2.65%。夏末秋初采摘的叶片中所含的2种活性黄酮物质含量普遍高于冬季采摘样品。此外,叶龄对2种成分的含量也有影响,修枝所得柚叶多为新长出的嫩叶,其含量高于长期无人管理、修剪的老叶。通贤镇四方村为通贤柚科技园区,栽培技术更为规范,其叶片所含两种活性物质的含量较高。

文献报道柚叶中含有柚皮苷元(柚皮素)[11-12],但本实验并未在通贤柚叶中发现柚皮素。推测是由于通贤柚与文献报道的柚树品种不同,且生长环境特征相异,导致柚叶中累积的次生代谢产物有别。

表6 加样回收实验结果

表7 样品含量测定结果

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Determination of two flavonoids in Tongxian grapefruit leaves by HPLC-DAD

HUANG You-qiu1,ZHAO Xue-li1,CHEN Xi1，YOU Yuan-yuan1,2,*

(1.Pharmaceutical College,Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China;2.Key Laboratory of Structure-specific Small Molecule Drug Research of Sichuan Province,Chengdu 610083,China)

Objective:To develop a HPLC-DAD method to determine the content of naringin and rhoifolin in Tongxian grapefruit leaves. Methods:HPLC was performed on a Sepax Amethyst C18-H analytical column(250mm×4.60mm,5μm)with gradient elution using acetonitrile and 0.1% aqueous formic acid as the mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min. The detection wavelength was 283nm for naringin,337nm for rhoifolin. The column temperature was 25℃ and the injection volume was 20μL. Results:The chromatographic peaks of naringin and rhoifolin could be separated well in the above cases. The linear ranges for the two flavonoids were 0.0653～0.6526mg/mL and 0.0350～0.3505mg/mL,respectively. The average recoveries were 98.68% and 98.47%,respectively.Conclusion:The established method could be used for the quality control of Tongxian grapefruit leaves.Harvest season and leaves age affect the content of two flavonoids significantly.

Tongxian grapefruit leaves;HPLC-DAD;naringin;rhoifolin;content assay

2014-06-27

黄友秋(1990-),男,本科,研究方向:药学。

*通讯作者:游元元(1974-)，女，博士，副教授，研究方向：中药品种、品质、药效和资源开发。

国家自然科学基金项目(31201946)；四川省教育厅科研项目(13ZC074)；四川省“高等教育质量工程”建设项目。

TS209

A

1002-0306(2015)07-0286-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.052