血清cf－DNA水平对子宫颈癌患者诊断和生存状况的判断价值

冯达红，王 敏

（1.商洛市商州区人民医院妇产科，陕西商洛726000；2.中国医科大学附属盛京医院，辽宁沈阳110004）

血清cf－DNA水平对子宫颈癌患者诊断和生存状况的判断价值

冯达红1，王 敏2

（1.商洛市商州区人民医院妇产科，陕西商洛726000；2.中国医科大学附属盛京医院，辽宁沈阳110004）

目的 探讨血清cf－DNA定量检测在宫颈癌辅助诊断及生存状况判断中的价值。方法 分别采集2008年3月至2009年3月我院收治的宫颈癌患者及门诊体检健康妇女各100例的血清。运用荧光定量RT－PCR方法检测血清cf－DNA含量，采用化学发光法检测血清中鳞状细胞癌抗原（SCC）、细胞角蛋白19片段（CYFRA21－1）、糖类抗原125（CA125）、糖类抗原19－9（CA19－9）的含量。结果 宫颈癌患者和健康对照者血清cf－DNA浓度检测结果分别为134.5（7.9－1721.3ng／ml），18.3（0.32－47.5）ng／ml，宫颈癌患者的cf－DNA明显高于健康对照组（Z＝－7.324，P＜0.001）。用ROC曲线分析血清cf－DNA浓度对宫颈癌患者的诊断效能，其曲线下面积（0.923），高于传统指标血清SCC（0.721）、CYFRA21－1（0.734）、CA125（0.652）、CA19－9（0.617）。生存时间＞5年患者的血清cf－DNA浓度明显低于生存时间＜5年的患者（Z＝6.438，P＜0.001）。结论 血清cf－DNA水平有助于宫颈癌的辅助诊断及预后判断。血清cf－DNA对宫颈癌的辅助诊断价值要优于传统肿瘤标志物。

宫颈癌；cf－DNA；肿瘤标记物，生存时间

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1475）

宫颈癌是女性常见的生殖道肿瘤，是女性第二大高发癌症［1］。早期诊断和及时治疗宫颈癌对降低宫颈癌发生率和病死率具有重要的意义。常见的宫颈癌相关肿瘤标志物有鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）、细胞角蛋白19片段（CYFRA21－1）、糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、糖类抗原19－9（carbohydrate antigen 19－9，CA19－9）［2，3］。近年来外周血游离DNA（cell－free DNA，cf－DNA）已成为检测多种肿瘤的标志物之一［4－6］。因此我们对2008年3月至2009年3月确诊的100例宫颈癌患者的外周血cf－DNA、SCC、CYFRA21－1、CA125和CA19－9水平进行了检测，分析其与宫颈癌患者的诊断与生存状况的关系。通过实验结果来探讨血清cf－DNA对宫颈癌诊断和生存状况的判断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2008年3月至2009年3月于我院妇科住院宫颈癌患者100例，其中鳞癌患者74例，腺癌患者26例。按国际妇产科协会宫颈癌分期标准分期，Ⅰ期62例，年龄32－65岁，平均48.31±8.92岁；Ⅱ－Ⅲ期38例，年龄35－73岁，平均52.95±7.81岁。细胞分级：高分化23例，中分化者47例，低分化者25例，无法分级者5例。诊断均经组织病理学证实，均无其他合并症。同期门诊体检健康妇女100名，年龄28－62岁，平均43.31±9.24岁。记录宫颈癌患者的死亡情况，时间截止至2014年3月。

1.2 标本采集 采集研究对象外周静脉血5ml置于含有分离胶的生化管中，轻轻颠倒混匀4－5次，放置30min，待血液充分凝固后以离心半径8cm 3 000r／min离心10min，分离血清，置于－20℃冰箱中保存待测。

1.3 血清cf－DNA的测量 （1）血清cf－DNA的抽提：采用上海奇诺肿瘤生物技术公司研制的PAS血清游离DNA抽提试剂，其操作步骤见说明书。（2）EGFR引物［7］：上游引物：5’－CCTGTCATAAGTCTCCTTGTTGAG－3’；下游引物：5’－CAGTCTGTGGGTCTAAGAGCTAATG－3’；（3）荧光定量PCR检测EGFR胞浆区外显子28编码引物序列，取2μL的DNA进行定量PCR检测，据公式计算出血清游离DNA含量（单位：拷贝数／ml血清）。C＝10×Q／Vext［（公式中C：EGFR拷贝数、Q：CPD（Cytoplasmic Domain）拷贝数、Vext：用于抽提DNA的血清体积（mL）］，再将C按标准曲线转换得到游离DNA含量（ng／mI）。

1.4 血清SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的检测 在化学发光仪ARCHITECT i2000（美国雅培公司）上进行检测，严格按照仪器和试剂说明书进行操作，SCC以1.5μg／L为阳性界值，CYFRA21－1以3.3ng／ml为阳性界值，CA125以35U／ml为阳性界值，CA19－9以40U／ml为阳性界值。

1.5 统计方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，cf－DNA及SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的浓度以中位数和四分位数间距表示。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示。非正态分布数据采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌患者与健康对照血清cf－DNA浓度

宫颈癌患者和健康对照者血清cf－DNA浓度检测结果（以19ng／ml作为阳性临界值）分别为134.5（7.9－1721.3ng／ml），18.3（0.32－47.5）ng／ml，宫颈癌患者的cf－DNA明显高于健康对照组（Z＝－7.324，P＜0.001）。

2.2 SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的浓度

采用化学发光法检测100例宫颈癌患者和100名健康对照者血清SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的含量，见表1。

表1 宫颈癌患者和健康对照者SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的浓度

2.3 各检测项目对宫颈癌癌诊断价值的比较

血清游离DNA含量和肿瘤标志物SCC、CYFRA21－1、CA125对宫颈癌诊断价值比较，见表2。对宫颈癌患者血清cf－DNA浓度及SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9分别结合健康对照组做ROC曲线，其曲线下的面积（AUC）分别为0.923、0.721、0.734、0.652、0.617。

2.4 宫颈癌患者血清cf－DNA及肿瘤标志物与生存状况的关系

根据患者治疗后生存时间是否＞5年，将100例宫颈癌患者分为两组，回顾性分析这两组患者血清cf－DNA及肿瘤标志物，见表3。

表2 各种肿瘤标志物的宫颈癌诊断价值

3 讨论

目前中国宫颈癌发病率和病死率处于相当高的水平，2003－2007年宫颈癌发病率为9.62／10万，同期宫颈癌死亡率为2.54／10万，在癌症死亡原因中排列第14位［8］。宫颈癌的早期筛查及诊治成为保障女性健康的重要措施之一。积极寻找一种测量方法简单、创伤小、灵敏度高、特异性好的新型肿瘤标志物对于宫颈癌的早期辅助诊断和治疗具有非常重要的意义。宫颈癌相关肿瘤标志物是宫颈癌组织和细胞由于癌基因及其产物的异常表达所产生的抗原和生物活性物质，其对宫颈癌的辅助诊断、估计预后及靶向治疗等均具有重要指导意义［9］。但是单项使用肿瘤标志物对早期宫颈癌检测的灵敏度和特异度均不能满足临床需要，常常需要联合检测来提高宫颈癌检测的灵敏度［3，10］。自从1977年Leon等［11］发现在肿瘤患者体内存在cf－DNA之后，血cf－DNA逐渐成为肿瘤标相关志物之一，引起广泛的关注。本研究通过检测宫颈癌患者和健康对照者血清cf－DNA含量，我们发现宫颈癌患者的血清cf－DNA水平明显高于健康对照者（P＜0.001），这一结果说明了血清cf－DNA浓度的升高与宫颈癌的发生密切相关。

临床上常用来检测宫颈癌的肿瘤标志物有SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9等［2，9］。SCC是一种特异性高的鳞癌肿瘤标志物，对所有鳞状上皮细胞起源的癌症如宫颈癌、食管癌等的诊断及预后判断有辅助作用［12］。目前研究发现CYFRA21－1在某些恶性肿瘤患者升高，如肺癌、宫颈癌及消化道肿瘤等［13，14］。血清CA125是宫颈癌腺癌常用的筛查指标。CA19－9是大分子量的糖蛋白抗原在各种腺癌中都可升高，特异性较差。本次实验中宫颈癌患者SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9含量均高于健康对照者，其中，SCC、CYFRA21－1和CA125具有统计学差异（P均＜0.05），CA19－9未见显著差异。在cf－DNA与SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的ROC曲线下面积及灵敏度、特异度相比较后发现，cf－DNA的ROC曲线下面积（0.923）、灵敏度（81.0%）、特异度（93.0%）及准确性（87.0%）均要高于SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9。

一些研究发现肿瘤标志物的表达高低与癌症生存时间的关系密切相关［14］。本研究结果发现，生存时间大于5年的宫颈癌患者cf－DNA、SCC与CYFRA21－1的表达均低于生存时间小于5年的患者。因此，这三种肿瘤标志物的表达水平可以初步反映宫颈癌癌患者生存期长短的重要指标，可用作评估患者的生存时间。因此，本研究认为，cf－DNA对宫颈癌的诊断价值要优于传统的肿瘤标志物SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9。另外cf－DNA与SCC、CYFRA21－1对判断宫颈癌患者的生存状况有一定的指导意义。

表3 宫颈癌患者血清cf－DNA及肿瘤标志物与生存状况的关系

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2008［J］.CA Cancer J Clin，2008，58（2）：71.

［2］童红莉，李 娟，温新宇，等.肿瘤标志物联合检测在宫颈癌诊断中的应用价值［J］.标记免疫分析与临床，2011，（03）：160.

［3］钟 倩，刘婉敏，芦雅萍，等.5种肿瘤标志物检测在卵巢肿瘤的临床意义［J］.中国实验诊断学，2010，（06）：876.

［4］BP FOX RK－CG.DNA－based assay for EPHB6expression in breast carcinoma cells as a potential diagnostic test for detecting tumor cells in circulation［J］.Proteomics，2010，7（1）：9.

［5］朱 响，吴 晖，袁爱华，等.血浆游离DNA在恶性肿瘤诊疗中的应用［J］.国际肿瘤学杂志，2014，41（3）：180.

［6］拜红霞，戴 洋.血清游离DNA在肿瘤诊断中的研究进展［J］.检验医学与临床，2011，8（09）：1110.

［7］Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，et al.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non－small－cell lung cancer to gefitinib［J］.N Engl J Med，2004，350（21）：2129.

［8］李 霓，郑荣寿，张思维，等.2003－2007年中国宫颈癌发病与死亡分析［J］.中国肿瘤，2012，（11）：801.

［9］徐跃勋，吕锡芳，李文婷，等.宫颈癌肿瘤标志物的研究进展［J］.现代生物医学进展，2010，（09）：1777.

［10］马开慧，金 晔，王 炜.四项肿瘤标志物联合检测在肺癌辅助诊断中的应用价值［J］.中国实验诊断学，2013，（12）：2288.

［11］Leon SA，Shapiro B，Sklaroff DM，et al.Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy［J］.Cancer Res，1977，37（3）：646.

［12］Gadducci A，Tana R，Cosio S，et al.The serum assay of tumour markers in the prognostic evaluation，treatment monitoring and follow－up of patients with cervical cancer：a review of the literature［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2008，66（1）：10.

［13］罗 玲，王江红.支气管肺泡灌洗液SCCA、CYFRA21－1、CEA联合检测在肺癌诊断中的价值［J］.重庆医科大学学报，2010，（11）：1716.

［14］叶 清，蒋捍东.肺癌患者血清肿瘤标志物水平变化与化疗疗效及生存时间的相关性［J］.中华肺部疾病杂志（电子版），2013，6（6）：9.

Judgment Value of diagnosis and survival condition of cf－DNA serum level in patients with cervical cancer

FENG Dahong，WANG Min.（Shangluo District People＇s Hospital of Shangluo City，Shangluo 726000，China）

Objective To investigate the quantitative detection of serum cf－DNA in the diagnosis and survival time of cervical cancer.Methods To take serum samples from 100patients diagnosed with cervical cancer and 100healthy controls from March 2008to March 2009in our hospital.Fluorescence quantitative RT－PCR method was used to detect serum cf－DNA content，chemiluminescence was taken to detect the level of serum squamous cell carcinoma antigen（SCC），cytokeratin 19fragment（CYFRA21－1），carbohydrate antigen 125（CA125），sugar antigen 19－9（CA19－9）.Results The concentration of serum cf－DNA in cervical cancer patients and healthy controls were 18.3（0.32－47.5）ng／ml，134.5（7.9－1721.3ng／ml），repectively.The concentration of serum cf－DNA in cervical cancer patients was significantly higher than the control group（Z＝－7.324，P＜0.001）.ROC curves was used to analysis the diagnostic performance of serum cf－DNA in cervical cancer patients with，the area under the curve（0.923）was higher than the traditional serum indicators such as SCC（0.721），CYFRA 21－1（0.734），CA125（0.652），CA19－9（0.617）.Concentration of serum cf－DNA in patients whose survival time was less than 5－year was significantly lower than it in the the patients whose survival time more than 5years（Z＝6.438，P＜0.001）.Conclusion The level of serum cf－DNA may benefit the diagnosis and prognosis of cervical cancer.The aided diagnostic value of serum cf－DNA in cervical cancer was better than conventional tumor markers.

cervical cancer；cf－DNA；tumor markers，survival time

R737.33

A

2014－07－22）

1007－4287（2015）09－1475－03