当归补血汤对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌纤维化的影响*

曾 宇，张三印

(成都中医药大学，四川 成都 611137)

当归补血汤对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌纤维化的影响*

曾 宇，张三印△

(成都中医药大学，四川 成都 611137)

目的 探讨当归补血汤对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌纤维化的影响。方法 50只SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、当归补血汤大剂量组、当归补血汤小剂量组、阳性对照组。除空白对照组，其它四组大鼠给予背部皮下注射异丙肾上腺素5 mgkg-1d-1，连续10天。阳性对照组给予卡托普利50 mg/kg-1灌胃，当归补血汤大和小剂量组给予当归补血汤各7.56 g/kg-1和3.78 g/kg-1灌胃，空白对照组和模型对照组给予等体积的生理盐水灌胃，每天一次。连续给药28d后，给予血流动力学检测，计算心脏指数，病理检测，Hpy含量检测。结果 与空白对照组比较，模型对照组的心脏指数升高(P<0.05)，左心功能降低，Hpy含量增加(P<0.01)。与模型对照组比较，当归补血汤大剂量、小剂量组大鼠心肌纤维化病变程度降低，心脏组织的Hpy含量降低，左心功能有改善。结论 当归补血汤能抑制心肌间质细胞产生胶原蛋白，减轻心肌纤维化，改善左心功能。

心肌纤维化；当归补血汤；羟脯氨酸

心肌纤维化(Myocardial Fibrosis)是由多种心血管疾病发展到一定程度时可引起心肌纤维，并逐渐发展为慢性缺血性心脏病；同时在心肌纤维化是心室重构的关键原因，出现舒张功能障碍[1-2]。因此加强对心肌纤维化的研究和防治具有重要的临床意义。我国的中医药对心肌纤维化有独特的疗效[3-4]，且副作用少。当归补血汤是金典的补气益气方，由当归和黄芪两味中药组成，其治疗心血管疾病的报道屡见不鲜，疗效显著。本研究观察当归补血汤对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌纤维化的影响。

1 材料

1.1 动物 SD大鼠 50只，雄性，体重200-220 g，SPF级，购自简阳市简城比尔动物养殖场，许可证号SCXK(川)2013-24。

1.2 药品与试剂 异丙肾上腺素(上海伊卡生物技术有限公司)，卡托普利(汕头金石制药厂)。当归(产于甘肃)、黄芪(产于内蒙古)由成都中医药大学生药教研室国锦琳副教授鉴定。当归180 g，黄芪900 g，水煎，使用旋转蒸发仪浓缩为每毫升含1 g药。Elisa试剂盒(Abcam公司)。水合氯醛(成都市科龙化工试剂厂)。无水乙醇(成都科龙化工试剂厂)。二甲苯(成都科龙化工试剂厂)。甲苯胺蓝(上海如吉生物科技发展公司)。苏木素(北京百灵威科技有限公司)。丽春红(成都科龙化工试剂厂)。

1.3 仪器 Powerlab生理记录系统(埃德仪器国际贸易有限公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，电子秤(德国Sartorius公司)，酶标仪(赛默飞世尔仪器有限公司)，电子恒温浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)，移液枪(大龙兴创实验仪器有限公司)，枪头(美国Axygen公司生产)，EP管(美国Axygen公司生产)

2 方法

2.1 心肌纤维化动物模型的制备 大鼠背部皮下注射异丙肾上腺素5 mg/kg-1·d-1，连续10d。自由进食进水，空白对照组注射同体积的生理盐水。

2.2 分组与给药 大鼠随机分为5组，空白对照组，模型对照组，阳性对照组，DBT大剂量组、DBT小剂量组。每组10只。灌胃给药28 d，每天1次，阳性对照组给予卡托普利50 mg/kg-1，DBT大和DBT小剂量组分别给予当归补血汤7.56 g/kg-1和3.78 g/kg-1灌胃，空白对照组和模型对照组给予等体积的生理盐水。

2.3 心功能检测 灌胃28天后，称重，用10%水合氯醛0.3 mL/kg-1腹腔注射麻醉大鼠。固定。剪去颈部毛，颈部做一“L”型切口，分离筋膜和肌肉，找到颈动脉鞘，分离出颈总动脉。结扎颈总动脉远心端，动脉夹夹住近心端，在结扎处附近做以小切口，插入Millar导管，固定导管，松开动脉夹，继续推入导管，观察电脑屏幕血压的变化，当有落空感和血压最低接近0 mmHg，出现心室波时，则导管进入左心室[5]。选择一段好的波形进行软件分析。

2.4 标本采集与制备 心功能检测完后，剪开胸腔，取出心脏，蒸馏水冲洗，滤纸吸干水分，分离左心室，分别称出全心重量和左心室重量。在近心尖5 mm处取左心室组织，固定，制备病理切片。剩余左心室组织保存于-80℃冰箱中，用于测量心肌Hyp含量。

2.5 组织病理学与心肌纤维化检测 大鼠心肌组织用4%多聚甲醛固定，经脱水、石蜡包埋、切片(5 um)，分别进行HE染色和MASSON胶原特异染色。对切片进行图像采集，每张切片于100倍下观察组织，再根据表达情况分别选取1-3个区域400倍采集图像。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定采集全部图像的平均光密度，取平均值。

2.6 心肌组织Hyp含量测定 采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(Elisa)测定大鼠心肌组织羟脯氨酸(Hyp)的水平。向预先包被了大鼠羟脯氨酸单克隆抗体的酶标孔中加入羟脯氨酸，温育；温育后加入生物标记的抗Hyp抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，去除为结合的酶，加入显色剂。颜色的深浅与样品中大鼠羟脯氨酸的浓度呈正相关。

3 结果

3.1 对心肌纤维化大鼠心脏指数的影响 与空白对照组比较，模型对照组的心脏指数升高(P<0.05)，表明异丙肾上腺素能促进心肌胶原纤维增生，是心脏质量增加。与模型对照组比较，DBT大剂量组、DBT小剂量组和阳性对照组的心脏指数均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组、DBT大剂量组、DBT小剂量组、阳性对照组之间的差异无统计学意义。见表1。

表1 当归补血汤对心肌纤维化大鼠心脏指数的影响±s，n=8)

注：与模型对照组比较，#P<0.05。

3.2 对心肌纤维化大鼠心功能的影响 与空白对照组比较，模型对照组SW、CO、Pes、EF、dP/dt max、-dP/dt min、-dV/dt min降低(P<0.05)，表明异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化大鼠左心功能下降。与模型对照组比较：DBT大剂量组SW、EF、dV/dt max、-dV/dt min升高(P<0.05)；DBT小剂量组EF、-dV/dt min升高(P<0.05)；阳性对照组EF升高(P<0.05)。以上数据表明DBT大剂量和DBT小剂量有改善大鼠左心功能的作用。见表2。

表2 当归补血汤对心肌纤维化大鼠心功能的影响±s，n=8)

注：#P<0.05，与空白对照组比较；*P<0.05，与模型对照组比较。1mmHg≈0.133kPa。SW：每搏功，CO：每分心输出量，Ped：舒张压，Pes：收缩压，EF：射血分数，dP/dt max：压力上升速率最大值，-dP/dt min：压力下降速率最大值，dV/dt max：容积上升速率最大值，-dV/dt min：容积下降速率最大值。

3.3 当归补血汤对心肌组织病理变化的影响 空白对照组心肌纤维排列正常。模型对照组的心肌纤维排列紊乱，可见波浪样变，心肌间隙增大，部分心肌细胞变性和溶解坏死，肌间纤维结缔组织大片增生，毛细血管扩张增生，其间可见大量单核、淋巴细胞的浸润和成纤维细胞的增生。与模型对照组比较，DBT大剂量和DBT小剂量及阳性对照组的心肌纤维化病灶局限，病变明显较轻，表明当归补血汤可以减轻异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化。见图1、2。

图1 当归补血汤对心肌组织病理变化的影响(HE染色，×400)

图2 当归补血汤对心肌组织病理变化的影响(MASSON染色，×400)

3.4 对心肌纤维化大鼠心脏组织Hpy的影响 模型对照组大鼠心肌组织中Hpy含量显著高于空白对照组(P<0.01)；DBT大剂量组与阳性对照组心肌组织中Hpy含量明显低于模型对照组；DBT小剂量组大鼠心肌组织中Hpy含量降低不明显(P>0.05)。见表3。

表3 当归补血汤对各组大鼠心脏组织Hpy的影响±s，n=8)

注：#P<0.05、##P<0.01，与空白对照组比较；*P<0.05、**P<0.01，与模型对照组比较。

4 讨论

当归补血汤是金元时代李东恒所创的益气补血方剂，由黄芪和当归两味药以5∶1比例组成，具有促进造血、调节免疫功能、保护心脑血管等作用[6-7]。有研究发现黄芪、当归有抑制胶原增生，减轻心肌纤维化的作用[8-10]。因此本实验采用金典方当归补血汤对心肌纤维化大鼠进行研究，推广当归补血汤的应用。

研究表明[11]，卡托普利可以抑制大鼠心肌纤维化，故本实验以卡托普利作为阳性对照药物。

异丙肾上腺素属于儿茶酚胺类物质，连续皮下注射造成多发性灶状心肌坏死导致心肌纤维化[12-13]。本实验中模型对照组大鼠心脏指数、心肌Hpy含量明显高于空白对照组，病理切片可见大量胶原纤维增生，左心功能明显下降；表明大鼠心肌纤维化模型建立成功。DBT大剂量组大鼠心脏组织的Hpy含量明显低于模型对照组；DBT小剂量也有降低，但无统计意义。从生化检验和形态学分析表明，大剂当归补血汤能抑制心肌间质细胞产生胶原蛋白，减轻心肌纤维化，改善了左心功能。有研究表明异丙肾上腺素引起心肌纤维化不仅与自身的β受体激动剂的特点有关，还与影响心肌纤维化形成的细胞因子有关[14-15]，因此当归补血汤改善异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化的分子机制，还需进一步研究。

[1]Swynghedauw B.Molecular mechanism of myocardical remodeling[J].Physiol Rev，1999，79(1)：25.

[2]Chaturvedi RR，Herron T，Simmons R，et al.Passive stiffness of myocardium from congenital heart disease and implications for diastole[J].Circulation，2010，121(8)：979-988.

[3]曹丕钢，喻正科.中医药干预心肌纤维化的实验研究进展[J].湖南中医药大学学报，2013，29(11)：132-134.

[4]李霞，谭元生.中医药防治心肌纤维化作用的研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志，2014，12(2)：229-231.

[5]Pal Pacher，Takahiro Nagayama，Partha Mukhopadhyay，et al.Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats[J].Nat Protoc，2008；3(9)：1422-1234.

[6]Zheng KY，Choi RC，Cheung AW，Guo AJ，Bi CW，Zhu KY，et al.Flavonoids from Radix Astragali induce the expression of erythropoietin in cultured cells：a signaling mediated via the accumulation of hypoxia-inducible factor-1alpha.Journal of agricultural and food chemistry.2011，59(5)：1697-704.

[7]Xu Ting Li，Bin Wang，Jin Liang Li，et al.Effects of Dangguibuxue Tang，a Chinese herbal medicine，on growth performance and immune responses in broiler chicks.Biol Res，2013，46：183-188.

[8]张召才，李双杰，杨英珍等.黄芪甲苷对慢性心肌炎心肌纤维化的影响[J].中国中西医结合杂志，2007(8)：728-731.

[9]LiZi-pU，Cao Qian，Pang Xiu-ying.Dosage and time effects of astragaloside IV on myocardial collagen and cardiac function of ischemic rats[J].Chinese Journal of Clinical Rehabilitation，2005，9(23)：207-209.

[10]艳峰，徐江，汤剑青，等.当归对大鼠心肌梗死后心肌纤维化的影响及机制[J].中国病理生理杂志，2005，22(10)：1965-1969.

[11]赵智明，郭郡浩，商玮，等.卡托普利对压力负荷增加大鼠心肌纤维化的影响[J].现代中西医结合杂志，2010，19(1)：21-23.

[12]陈蓉，谢梅林.异丙肾上腺素致小鼠心肌纤维化模型的制备及评价[J].中国药理学通报，2014，30(9)：1325-1328.

[13]李萌，吕仕超.不同原因诱导的心肌纤维化动物模型的建立[J].医学研究生学报，2014，27(3)：330-333.

[14]张玲，王洪新.异丙肾上腺素对大鼠心肌纤维化和相关细胞因子的影响[J].中国临床药理学与治疗学，2005，10(10)：1186-1189.

[15]余树青.异丙肾上腺素诱导心肌病理损伤机制的研究进展[J].医学综述，2014，20(4)：613-615.

Influence ofDangguiBuxueDecoctionon Myocardial Fibrosis of Isoproterenol Induced Rats

ZENG Yu, ZHANG San-yin

(ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu611137,Sichuan)

Objective: To study the influence ofDangguiBuxueDecoction(DBD) on myocardial fibrosis of isoproterenol-induced rats. Methods: 50 SD rats were randomly divided into a normal control group, a model group, a DBD high-dose group, a DBD low-dose group and a positive control group. Except the normal control group, the rats of other four groups were given subcutaneous injection of isoproterenol 5 mg/kg-1d-1for 10 days. The positive control group was given intragastric infusion of captopril 50 mg/kg-1. The DBD high-dose and low-dose groups were given intragastric infusion of DBD 7.56 g/kg-1and 3.78 g/kg-1respectively. The normal control group and the model group were given intragastric infusion of equivoluminal?normal saline, once a day. After 28-day successive administration, hemodynamics detection, cardiac index calculation, pathological examination and Hpy content detection were made. Results: When compared with the normal control group, the cardiac index of the model group increased (P<0.05), their left ventricular function decreased and Hpy content increased (P<0.01). When compared with the model group, the DBD high-dose and low-dose groups reduced the severity of myocardial fibrosis lesion of the rats and their Hpy content of heart tissue decreased and their left ventricular function improved. Conclusion: DBD can inhibit myocardial interstitial cells to produce collagen, reduce myocardial fibrosis and improve left ventricular function.

myocardial fibrosis,DangguiBuxueDecoction, hydroxyproline

国家自然科学基金项目(81001497)，成都中医药大学校基金项目(030018060)。

曾宇(1986-)，女，汉族，四川，助教，硕士，研究方向：中医药及血管生成，E-mail：595279347@qq.com。

△通信作者：张三印(1976-)，男，汉族，陕西，教授，博士，研究方向：中医药及血管生成，E-mail：tcmzsy@126.com。

R541

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1007-2349(2015)07-0017-05

2015-05-17)