金雀异黄素对雌激素依赖靶基因转录的调节作用

孙莹 孙肃 孙静

[摘要] 目的 观察金雀异黄素（genistein，GNT）对雌激素受体（estrogen receptor，ER）靶基因的转录调节作用。 方法 采用不同浓度的金雀异黄素（5、10、20 ng/mL）+雌二醇（10 ng/mL）或雌二醇单独处理乳腺癌细胞MCF7，36 h后收集细胞检测金雀异黄素对雌激素反应元件（estrogen response element，ERE）报告基因的转录调控作用，通过定量PCR技术检测金雀异黄素对ER靶基因PDZK1和GREB1转录水平的影响。 结果 随着金雀异黄素浓度的增高，ER报告基因的转录水平逐渐下降，与之相一致，PDZK1和GREB1的转录水平也逐渐下降，组间差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 金雀异黄素能够与雌二醇竞争结合细胞表面的ER，并拮抗ER调控的靶基因表达。

[关键词] 金雀异黄素；雌二醇；雌激素受体；转录调控

[中图分类号] R344+.13；R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）02（a）-0012-03

植物中有各种抗炎抗肿瘤作用的活性物质[1]，大豆异黄酮是已知的植物雌激素，在预防和治疗肿瘤、心血管疾病、骨质疏松症和绝经后综合征等方面的作用已经得到广泛认可[2]。金雀异黄素化学名为4，5，7-三羟基异黄酮，性状是淡黄色树枝状针晶粉末，熔点（mp）297～298℃，溶于常用的有机溶剂，几乎不溶于水，溶于稀碱中呈黄色。金雀异黄素（又称染料木素）是来源于豆类植物和齿状植物的异黄酮类化合物，可通过影响一系列的细胞信号通路，发挥广泛的预防和治疗肿瘤作用[3-5]。金雀异黄素是一种强力的酪氨酸蛋白激酶和拓扑异构酶抑制剂，通过抑制以上两种酶的活性，达到对癌基因的调控，从而实现多途径抑制肿瘤的生长转移[6]。金雀异黄素（Genistein）增加性激素结合球蛋白合成，从而降低激素生物利用度，降低雌激素依赖细胞增殖活性，减少激素相关肿瘤的发生。但金雀异黄素水溶性很低，直接服用不利于人体吸收[7]，能否降低雌激素的生物利用度，抑制雌激素调控的靶基因表达目前还不明确。金雀异黄素抗癌研究已经成为全球热点，并已取得很大进展[8]。本文通过报道基因及实时定量PCR实验证实金雀异黄素能够和雌二醇竞争乳腺癌细胞表面的雌激素受体（ER），并抑制ER调控靶基因的表达，现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌细胞系MCF7购自北京协和细胞库。雌二醇（纯度99%）购自北京四环制药厂；金雀异黄素（纯度98%）购自Sigma公司；DMEM培养基及Real Mastermix（SYBR Green）购自天根公司；反转录试剂盒购自Invitrogen公司；Fugene 6转染试剂为Roche Diagnostics公司产品；双报告基因荧光素酶检测试剂盒为Promega公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 实验分为五组：单纯DMEM培养基不加药组；雌二醇组（10 ng/mL）；金雀异黄素5 ng/mL+雌二醇组；金雀异黄素10 ng/mL+雌二醇组；金雀异黄素20 ng/mL+雌二醇组。

1.2.2 报告基因检测 将乳腺癌细胞MCF7接种于24孔板，按“1.2.1”项下分组条件处理细胞，培养至对数生长期后，按照Fugene 6转染试剂说明将2.0 μg报告基因质粒pTAL-SEAP-ERE和校正质粒pSV-β-gal（10 ng）转染至乳腺癌细胞MCF7细胞中，继续培养36 h，收集细胞按照双报告基因检测试剂盒说明检测荧光素酶活性，每组3个复孔，每次数据重复3次。

1.2.3 Real-time PCR 将乳腺癌细胞MCF7细胞接种到6孔板中，按“1.2.1”项下分组条件处理细胞，48 h后收集细胞加入1 mL Trizol，按照Invitrogen反转录试剂盒说明反转录合成cDNA第一链。采用LightCycler实时定量PCR系统（Roche公司产品）进行Real-time PCR。Real-time PCR引物按照文献合成[9-10]。GREB1上游引物：5'-CAAAGAATAACCTGTTGGCCCTGC-3'，下游引物： 5'-CCAGTTGT-TGGCACTTCGG-3'；PDZK1上游引物：5'-AGAAATGGCCTCCACCTTCA-AC-3'， 下游引物5′-ACGGGCCCTCTAGACTCGAG-3'。GAPDH引物购自Takala公司。PDZK1和GREB1基因的扩增条件为：95°C预变性2 min；95°C变性10 s， 60°C退火10 s， 72°C延伸10 s，共45个循环；72°C延伸5 min。用GAPDH的定量值对待测基因的定量值进行均一化，进而得到待测基因的相对表达量。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金雀异黄素对ERE报告基因转录的抑制作用

加入雌二醇后，ERE报告基因的转录活性较不加药组提高约5倍，提示乳腺癌细胞MCF7细胞表面有ER表达，乳腺癌细胞MCF7细胞能够对雌激素产生应答；随着金雀异黄素浓度的增高，ERE报告基因的转录活性逐渐下降，金雀异黄素20 ng/mL+雌二醇组和雌二醇组比较差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），说明金雀异黄素能够和雌二醇竞争乳腺癌细胞MCF7细胞表面的ER，并抑制雌二醇的转录激活效应。见表1。

表1 金雀异黄素对ERE报告基因的转录调控作用（x±s，n = 3）

注：t值和P值为与雌二醇组比较；“-”表示无数据

2.2 金雀异黄素对ER靶基因PDZK1和GREB1转录的抑制作用

为了确定金雀异黄素是否影响ER靶基因的转录，本研究采用Real-time PCR法检测了ER靶基因PDZK1和GREB1 mRNA水平。结果显示，随着金雀异黄素浓度的增高，PDZK1和GREB1的转录水平逐渐下降，金雀异黄素20 ng/mL+雌二醇组和雌二醇组PDZK1和GREB1 mRNA水平差异均有高度统计学意义（P < 0.01），该结果和报告基因实验结果一致，说明金雀异黄素可以拮抗雌激素调控的靶基因表达。见表2。

3 讨论

金雀异黄素是来源于植物并有与雌激素相似结构的植物雌激素（phytocstrogen），其雌激素的调节作用引起广泛关注。目前植物雌激素作为激素替代药物、抗癌药物以及食品添加物和补充物应用[11]。大豆异黄酮是大豆产生的天然植物雌激素，其化学结构和雌二醇非常相似，而生物学活性却只有雌二醇的1/10万。近年研究证实，异黄酮的抗肿瘤效应主要是通过两种途径完成的，一种是ER依赖性，一种是ER非依赖性。在ER依赖途径中，异黄酮能够和雌激素竞争细胞表面的ER，进而拮抗雌激素调控的靶基因转录。在ER非依赖途径中，大豆异黄酮可以通过抑制酪氨酸蛋白激酶和拓扑异构酶发挥抗肿瘤作用。酪氨酸激酶及拓扑异构酶是细胞内重要的功能酶，很多参与细胞增殖及DNA损伤修复的功能蛋白均是它们的作用底物，抑制酪氨酸激酶和拓扑异构酶的活性，可以阻断细胞的生长激动信号，造成DNA损伤，促使细胞走向凋亡[12-14]。

徐琳琳等[15]认为，肿瘤的发生发展是多因素、多阶段的过程，其中既包括遗传因素也涉及到非遗传因素，如环境和饮食等。流行病学调查发现，摄入高含量的豆制品和绿茶可影响肿瘤及其他慢性疾病的发展[16]。金雀异黄素是大豆异黄酮的有效成分之一，已有研究资料表明，金雀异黄素是酪氨酸蛋白激酶和拓扑异构酶的强效抑制剂，金雀异黄素是否具有ER依赖性的抗肿瘤效应目前还不明确。雌激素在乳腺癌的起始和进展过程中充当重要角色，雌激素通过核受体超家族成员ER调节基因转录而控制生理和病理过程。ER是配体依赖型转录调节蛋白，它调控细胞生长和分化许多方面的基因程序[17]。在研究金雀异黄素与人类健康的关系时，从细胞分子水平、动物模型到人体实验、大规模流行病学调查的结果存在较大的争议，实验室中金雀异黄素用量通常远高于食物中的含量，且使用的种类、纯度、用量，采用的细胞系以及其他实验条件等均不尽相同，缺乏统一的评价标准，给金雀异黄素的研究工作和广泛应用带来一定的困难。随着对金雀异黄素功能性和营养性的深入研究，其提取及精制工艺的不断完善，金雀异黄素将会在医药、保健品、食品、饮料及其它行业得到越来越广泛的应用[18]。本文以ER表达的乳腺癌细胞MCF7作为研究对象，用不同浓度的金雀异黄素和雌二醇共同处理乳腺癌细胞MCF7细胞，结果显示，金雀异黄素可以拮抗雌二醇的激动效应，并且其竞争效应和金雀异黄素的浓度具有相关性。金雀异黄素20 ng/mL+雌二醇组与单纯雌二醇组比较，PDZK1和GREB1基因的转录水平差异显著。这个结果说明金雀异黄素和大豆异黄酮的其他组分一样，具有ER依赖性及ER非依赖的双重抑癌效应，本实验为揭示金雀异黄素的作用机制提供了基础资料。

[参考文献]

[1] 饶澄，黄显.黄酮类化合物抗炎和抗肿瘤共同作用机制的研究进展[J].海峡药学，2010，22（6）：8-11.

[2] 伍莹，刘江华.金雀异黄素防治绝经后骨质疏松症机制的研究进展[J].国际病理科学与临床杂志，2007，27（6）：530-533.

[3] Farina HG，Pomies M，Alonso DF，et al. Antitumor and antiangiogenic activity of soy isoflavone genistein in mouse models of melanoma and breast cancer [J]. Oncology Reports，2006，16（4）：885-891.

[4] 王丽斌，王玉华.金雀异黄素抗肿瘤实验研究进展[J].实用肿瘤杂志，2012，27（1）：96-100.

[5] 逢晓云，沈金芳，贡沁燕.大豆异黄酮对大鼠血脂的影响及其体内外抗氧化作用研究[J].中国临床药理学与治疗学，2008，13（1）：62-67.

[6] 郭瑞霞，冯俊霞，贾会珍，等.金雀异黄酮-4′-O糖苷的合成方法研究[J].河南化工，2013，30（4）：36-38.

[7] 冯淑莹，李国明，侯琼，等.金雀异黄素/壳聚糖微球的制备及其释药性能[J].华南师范大学学报：自然科学版，2013，45（5）：64-67.

[8] 吕春秀.金雀异黄素诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展[J].实用癌症杂志，2011，26（1）：102-104.

[9] Hnatyszyn HJ，Liu M，Hilger A，et al. Correlation of GREB1 mRNA with protein expression in breast cancer：validation of a novel GREB1 monoclonal antibody [J]. Breast Cancer Research and Treatment，2009，122（2）：371-380.

[10] Wang P，Wang JJ，Xiao Y，et al. Interaction with PDZK1 is required for expression of organic anion transporting protein 1A1 on the hepatocyte surface [J]. Journal of Biological Chemistry，2005，280（34）：30143-30149.

[11] Naciff JM，Jump ML，Torontali SM，et al. Gene expreasion profile induced by 17alpha ethynyl eatradiol，bisphenolA，and genistein in the developing female reproductive system of the rat [J]. Toxicol SCI，2002，68（1）：184-199.

[12] 李欣，高金恒，陈国良.蛋白酪氨酸激酶抑制剂的研究发展[J].沈阳药科大学学报，2011，28（12）：1005-1012.

[13] Pavese JM，Farmer RL，Bergan RC. Inhibition of cancer cell invasion and metastasis by genistein[J]. Cancer and Metastasis Reviews，2010，29（3）：465-482.

[14] 韩磊，郭克建，周文平，等.Genistein对TGF-β1诱导人胰腺癌细胞上皮-间质样转化的作用[J].世界华人消化杂志，2008，16（21）：2359-2363.

[15] 徐琳琳，孙庆敏，罗璇，等.金雀异黄素通过调控miR-27a及其靶基因对卵巢癌细胞SKOV3生长的影响[J].中国临床药理学与治疗学，2012，17（12）：1321-1326.

[16] Zhou JR，Yu LY，Mai ZM，et al. Combined inhibition of estrogen-dependent human breast carcinoma by soy and tea bioactive components in mice [J]. International Journal of Cancer，2004，108（1）：8-14.

[17] 沈丽霞，牛建昭，王继峰.应用基因芯片技术检测金雀异黄素对乳腺癌T47D细胞雌激素受体相关信号通路基因表达的影响[J].北京中医药大学学报，2013，36（2）：100-103.

[18] 许银燕，管静.Genistein的生物学功能研究进展[J].医学综述，2010，16（5）：735-737.

（收稿日期：2014-10-05 本文编辑：程 铭）