羊肚菌液体深层发酵工艺优化的研究

滕国生，贾东旭,郭含笑,刘 勇,范春艳,武丽达,佟 毅,*

(1.吉林中粮生化有限公司(玉米深加工国家工程研究中心),吉林长春 130012;2.长春工业大学,吉林长春 130012;3.吉林大学生命科学学院,吉林长春 130012)

羊肚菌液体深层发酵工艺优化的研究

滕国生1,2，贾东旭3,郭含笑3,刘 勇1,范春艳1,武丽达1,佟 毅1,*

(1.吉林中粮生化有限公司(玉米深加工国家工程研究中心),吉林长春 130012;2.长春工业大学,吉林长春 130012;3.吉林大学生命科学学院,吉林长春 130012)

利用期望函数将菌丝体干重、胞内多糖、蛋白质及甘露醇含量综合为期望值Da,并以此作为实验的评价指标。应用Plackett-Burman设计对影响羊肚菌发酵罐液体培养条件的因素进行筛选,所选取的8个因素为发酵培养基初始pH、转速、发酵温度、接种量、通气量、发酵时间、种龄以及装液量。在得到装液量、接种量和初始pH为显著影响因素后,利用Box-Behnken设计深入优化。通过SAS Version 8.02软件对实验结果进行响应面回归分析,利用Matlab2012a软件对实验结果进行神经网络结合遗传算法分析,通过比较各模型Da预测值,即神经网络结合遗传算法分析结果,从而获得羊肚菌5L发酵罐液体培养最佳条件:初始pH6.83,转速200r/min,发酵时间 4.5d,发酵温度26℃,接种量3%,种龄3d,通气量200L/h,装液量 3.22L/5L。模型预测期望值0.5220,验证值0.4987,模型具有良好的拟合度及预测能力。

羊肚菌,液体发酵,Plackett-Burman设计,神经网络结合遗传算法,期望函数

羊肚菌[Morehellaesculenta],别称羊肚菜、羊肚蘑、羊肚子,在我国分布广泛,是世界公认的食用菌,其不仅口感好,肉质鲜嫩,而且富含营养价值,具有良好的药用价值[1-2]。羊肚菌富含多糖、蛋白类、氨基酸、甘露醇和脂肪酸等类成分,目前已探究其营养成分具有增强免疫、减缓疲劳、抗肿瘤和抗氧化方面均具有显著功效[3-4]。近年来,鉴于羊肚菌野生资源逐渐匮乏同时其子实体生长环境要求严格,其人工栽培技术尚未成熟,因此羊肚菌的液体发酵生产途径是解决其工业化、集约化的重要途径,近年来对羊肚菌液体深层发酵中培养基配方组分方面优化的研究常见报道,诸如聂建军等优化黑脉羊肚菌菌丝体培养基配方的研究[5],吴新宇等对新疆野生羊肚菌液体培养基组分的研究[6]等,而针对羊肚菌液体深层发酵工艺中培养基配方外的培养条件优化方面研究不多。

Plackett-Burman设计是一种两水平的实验设计方法,可以利用最少的实验次数,从众多的考察因素中快速筛选主要的影响因素,广泛地用于因子主效应的估计中[7]。响应面法包含设计实验方案、建立回归模型、评估因子效应、获得因子的最佳水平等功能,优于正交实验和因子实验等方法,具有实验次数少、周期短和精度高等优点[8]。遗传算法源于生物遗传学和适者生存的自然规律,是由美国Michigan大学Holland教授发展建立的[9]。其能够解决有约束的最优化问题,只需要给出目标函数、变量取值范围和需满足的其他等式和不等式的约束条件,就可以通过迭代,逐步搜索到最优解[10]。基于化学计量学的实验设计广泛应用于化学、化工以及生物方面[11-13]。

本研究先利用Plackett-Burman设计对影响羊肚菌发酵罐培养条件的诸多因素进行考察,对筛选得到的关键因素采用Box-Behnken设计深入优化,利用Design-Expert.V8.0.6.1软件对实验结果进行响应面回归分析,利用Matlab2012a软件对实验结果进行神经网络结合遗传算法分析,通过比较,获得羊肚菌5L发酵罐液体培养最佳条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊肚菌菌株,为中科院微生物所菌种保存中心购得CGMCC5.620。

甘露醇 标准品美国Sigma公司;甲醇 北京化工色谱;高碘酸钠、盐酸、MgSO4·7H2O、KH2PO4·3H2O、葡萄糖均为分析纯 购于北京化工厂;维生素B1、蔗糖、蛋白胨、酵母浸粉均为生化试剂 购于北京奥博星生物技术公司。

全自动在位灭菌发酵系统,5L全自动发酵罐,真空冻干机,德国Eppendorf 5810R型高速冷冻离心机,日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪。

1.2 培养方法

种子与发酵培养基:葡萄糖10g/L,蔗糖10g/L,蛋白胨10g/L,酵母浸粉10g/L,KH2PO4·3H2O 3g/L,MgSO4·7H2O 3g/L,VB10.1g/L。

种子培养:500mL摇瓶装入种子培养基200mL,接入5%的菌种培养液,26℃振荡(150r/min)培养,培养时间(种龄)按照优化条件所需进行。

1.3 分析方法

1.3.1 干重指标的测定 发酵时间截止后,收集200mL发酵液,5000r/min离心10min,弃去上清,添加适量蒸馏水水洗菌丝体并离心,收集最终沉淀,冷冻干燥,称量即可。

1.3.2 蛋白质含量的测定 采用凯氏定氮法测定菌丝体中蛋白质的含量[14]。

1.3.3 胞内多糖含量的测定 采用蒽酮硫酸法测定胞内多糖含量[15]。

1.3.4 甘露醇含量的测定 利用比色法测定菌丝体中甘露醇的含量[16]。

1.4 期望函数的建立

采用期望函数将菌丝体干重、胞内多糖、蛋白质和甘露醇的产量综合为一个考察指标期望值(Da),每一个考察指标(响应值)均按公式(1)转换成无量纲的期望值后,通过公式(2)综合为Da。期望函数的平衡尺度d范围为0～1,d=0时说明响应值严重偏离目标值,d=1说明响应值与目标值接近。d随着所期望的响应值增加而增加。由公示得出考察指标越重要,其权重值越高。yi值越高,Da值越大。羊肚菌发酵的考察指标和期望最低响应值,期望最高响应值及权重值如表1,其中yil为该考查指标的最低期望值,与公式(1)中Li等同,而yih为该考察指标的最高期望值,与公式(1)中Ei等同。

式(1)

w1+w2+w3+Λwi=1

式(2)

wi为第i个指标的权重值;n是考察变量的总数。

表1 期望函数参数表Table 1 The parameters of the desirability function

1.5 羊肚菌5L发酵罐培养条件优化

1.5.1 Plackett-Burman设计实验 采用Plackett-Burman实验对影响羊肚菌5L发酵罐液体培养条件的因素:发酵培养基初始pH、转速、发酵温度、接种量、通气量、发酵时间、种龄以及装液量进行考察,以Da作为评价指标,确定显著影响因素。本实验选取的影响因素共8个,选用N=12的Plackett-Burman设计表(见表2)。

表2 Plackett-Burman实验方案及结果Table 2 The design matrix and results of Plackett-Burman design

1.5.2 Box-Behnken设计实验 以Plackett-Burman设计实验结果为基础,采用3因素3水平的Box-Behnken中心组合实验设计,实验设计方案及结果见表4。利用SAS Version 8.02(SAS Institute Inc.,USA)软件对实验结果进行响应面回归分析,利用Matlab2012a软件对实验结果进行神经网络结合遗传算法分析,通过比较获得羊肚菌5L发酵罐液体发酵最近培养条件。

表4 Box-Behnken设计实验方案及结果Table 4 The design matrix and the results of Box-Behnken design experiment

1.5.3 验证实验 按照SAS Version 8.02(SAS Institute Inc.,USA)和Matlab2012a软件优化获得的5L发酵罐培养条件分别进行3组平行实验,以确定模型和优化方法的可靠性和准确性。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman实验结果分析

采用SAS Version 8.02(SAS Institute Inc.,USA)软件分析实验结果,得到多元一次方程(3)。

Y(Da)=0.3382+0.0074Z1+0.0222Z2-0.0425Z3-0.0049Z4+0.0107Z5-0.0006Z6-0.0069Z7+0.0477Z8

式(3)

决定系数(R2)用来评价模型的拟合度,R2值越接近1,模型预测能力越好。实验中R2=0.9949,说明99.49%的期望值变化可以用所建立的模型解释。F检验中p值被用来评价各因素的显著水平,当p<0.05被认为是具有统计学意义上显著性。回归分析结果如表3,p=0.0024,说明模型显著可靠,能很好地描述实验因素与响应值间的关系。各考察因素的重要性依次为Z8>Z3>Z2>Z5>Z1>Z7>Z4>Z6。其中显著影响因素分别为装液量(Z8),接种量(Z3),初始pH(Z2)和转速(Z5),其他因素的置信水平低于95%,为不显著项。根据方程(3)可知,发酵时间、转速和接种量的系数为正,表明对期望值具有正效应;相反,初始pH对期望值具有负效应,该结果说明增加发酵时间,转速和接种量的水平或者降低初始pH有利于提高期望值,增加羊肚菌的各有效成分产量。鉴于装液量(Z8),接种量(Z3)和初始pH(Z2),3个因素对结果影响处于极其显著下,因此基于该3个因素进行下一步优化。

表3 Plackett-Burman设计实验回归分析结果Table 3 The results of regression analysis of Plackett-Burman design experiment

注:显著性分析,p<0.001为***,p<0.01为**,p<0.05为*。

表5 回归模型方差分析Table 5 The regression model analysis of variance

2.2 响应面分析

采用SAS Version 8.02(SAS Institute Inc.,USA)对Box-Behnken设计实验所得数据进行响应面回归分析,获得经多元二次回归方程(4)。

Y(Da)=0.5019+0.0195V1-0.0051V2+0.0206V3-0.0047V1V2-0.0020V1V3-0.0007V2V3-0.0102V12-0.0202V22-0.0254V32

式(4)

模型中决定系数R2为0.9092,说明90.92%的期望值变化可通过该多项式解释。模型p<0.05证明了二次回归模型具有显著性。模型失拟项的F和p值分别为10.4308和0.0887,不显著。采用t检验对模型的各项系数进行显著性分析,结果如表5显示,一次项(V1和V3),二次项(V12、V22和V32)对响应值的影响具有显著性(p<0.05)。根据模型预测知,在发酵罐液体培养条件为:初始pH6.37,转速200r/min,发酵时间4.5d,发酵温度26℃,接种量4.51%,种龄3d,通气量200L/h,装液量3.99L/5L情况下,Da预测值为0.5159。

2.3 神经网络结合遗传算法分析结果

应用Matlab 2012a对实验数据进行计算,15组实验随机分为校正集(11组)、测试集(2组)和预测集(2组),用于建立并检测神经网络模型的适应性和预测能力。以逼近度(Dv)值做为评价指标优选神经网络中最佳隐含层节点数(公式5)。采用遗传算法来搜索基于实验数据内最大Dv值时的最佳条件,适应度函数的定义如公式(6)。此外,基于遗传算法的优化模拟将被重复使用,每次随机初始化优选方案的种群。不同的初始种群将用来确保每次遗传算法开始搜索都是始于不同搜索子集的优化方案,帮助定位最佳方案的搜索[7]。

式(5)

Fitness=-(响应值)

式(6)

根据Dv值,选择11为最佳隐含层节点数(图1A),最优神经网络模型的决定系数(R2)为0.9596,说明神经网络模型的拟合度好。训练集(RMSEc)、测试集(RMSEt)和预测集(RMSEp)的均方根误差分别为0.0101,0.0099和0.0117。当神经网络模型建立后,采用遗传算法优化发酵培养条件并获得预测期望值(图2)。优化后羊肚菌5L发酵罐液体培养条件为:初始pH6.83,转速 200r/min,发酵时间 4.5d,发酵温度26℃,接种量3%,种龄3d,通气量200L/h,装液量 3.22L/5L,此条件下预测期望值为0.5220。

图1 隐藏结点数对逼近度的影响Fig.1 Effect of the number of hidden nodes on Da

图2 遗传代数对拟合度的影响Fig.2 The effect of the number of generation on fitness

2.4 验证实验

按照SAS Version 8.02和Matlab2012a优化的羊肚菌5L发酵罐培养条件分别进行3组平行实验。采用SAS Version 8.02软件进行响应面分析得到的预测期望值为0.5159,平均验证结果为0.4779,误差7.36%。利用Matlab2012a软件进行神经网络结合遗传算法分析得到的预测期望值为0.5220,平均验证结果为0.4987,误差为4.46%。通过比较,神经网络结合遗传算法分析结果作为最佳的羊肚菌5L发酵罐液体培养条件:初始pH6.83,转速200r/min,发酵时间 4.5d,发酵温度26℃,接种量3%,种龄3d,通气量200L/h,装液量 3.22L/5L。

3 结论

本文利用期望函数将菌丝体干重、胞内多糖、蛋白质及甘露醇含量综合为期望值Da,并以此作为实验的评价指标。通过Plackett-Burman实验对影响羊肚菌发酵罐液体培养的8个因素进行筛选,在获得装液量、接种量和初始pH为显著影响因素后,对其利用Box-Behnken设计深入优化。分别利用SAS Version 8.02软件对实验结果进行响应面回归分析,利用Matlab2012a软件对实验结果进行神经网络结合遗传算法分析,通过比较各模型分析方法得到的预测期望值,综合预测期望值和平均测定值,即神经网络结合遗传算法分析结果为最佳,从而获得羊肚菌5 L发酵罐液体培养最佳条件:初始pH6.83,转速 200 r/min,发酵时间 4.5d,发酵温度26℃,接种量3%,种龄3d,通气量200L/h,装液量 3.22L/5L。本研究通过采用的多种统计学方法科学有效的对羊肚菌5L发酵罐液体培养条件进行逐步优化,为实际生产提供很好的指导作用。

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Optimization ofMorehellaesculentasubmerge fermentation conditions

TENG Guo-sheng1,2,JIA Dong-xu3,GUO Han-xiao3,LIU Yong1,FAN Chun-yan1,WU Li-da1,TONG Yi1，*

(1.Jilin COFCO Biochemistry CO. ,LTD(National Engineering Research center of Corn Processing),Changchun 130012,China;2.Changchun University of Technology,Changchun 130012,China;3.School of Life Sciences,Jilin University,Changchun 130012,China)

Using desirability function,four indexes including mycelium dry weight,intracellular polysaccharide,protein and mannitol yield were uniformed into one expected value(Da)which was further served as the assessment criteria. In our present study,Plackett-Burman design was applied to evaluate the effects of eight variables including initial pH,rotate speed,fermentation temperature,inoculum size,ventilation volume,culture time,inoculum age and loading volume on Da value duringMorehellaesculentasubmerge fermentation via fermenter. Culture time,initial pH and rotate speed were found to influence Da value significantly and were further optimized by Box-Behnken design. The data obtained from Box-Behnken design was analyzed by both with response surface regression(SAS Version 8.02 software)and neural network combining genetic algorithm method(Matlab2012a software). After compared Da predicted value of each model,the Da predicted value of neural network combining genetic algorithm method was the highest,so that the optimumMorehellaesculentasubmerge fermentation conditions via fermenter was obtained as follows:initial pH6.83,rotate speed 200r/min,culture time 4.5d,fermentation temperature 26℃,inoculum size 3%,ventilation volume 200L/h,inoculum age 3d,and loading volume 3.22L/5L. The predicted Da value of the optimum model was 0.5220 and the experimental Da value was 0.4987. The model possesses well fitness and predictive ability.

Morehellaesculenta;submerge fermentation;Plackett-Burman design;neural network combining genetic algorithm;Desirability function

2014-07-28

滕国生(1978-)，男，博士，讲师，主要从事生物发酵研究。

*通讯作者:佟毅(1963-)，男，博士，高级工程师，主要从事生物工程发酵的研究。

国家科技部重点支撑项目(2012BAL29B05)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.024