高效液相色谱法测定小儿导赤片中大黄素和大黄酚的含量*

徐士奎，张雯洁，罗艳秋，陶 静

(1.云南省食品药品检验所，云南 昆明 650011；2.云南中医学院，云南 昆明 650500；3.昆明医科大学，云南 昆明 650500)

高效液相色谱法测定小儿导赤片中大黄素和大黄酚的含量*

徐士奎1，张雯洁1，罗艳秋2，陶 静3

(1.云南省食品药品检验所，云南 昆明 650011；2.云南中医学院，云南 昆明 650500；3.昆明医科大学，云南 昆明 650500)

目的 建立小儿导赤片中大黄素、大黄酚含量测定的高效液相色谱法；方法 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%磷酸水溶液(79：21)为流动相，检测波长为254nm；结果 大黄素在4.072-40.72μg/ml范围内线性关系良好，平均回收率为95.84%；大黄酚在10.41-104.142μg/ml范围内线性关系良好，平均回收率为96.40%。结论 HPLC法能准确进行定量分析大黄素和大黄酚两种物质的含量。

小儿导赤片；大黄素；大黄酚；高效液相色谱

小儿导赤片是由大黄、栀子、滑石、地黄、甘草、木通、茯苓等7味药材加工制成的纯中药制剂，有清热利便的功效，治疗口舌生疮、咽喉肿痛、牙根出血、腮颊肿痛、爆发火眼、大便不利、小便赤黄等病症[1]，疗效显著。方中大黄苦寒泻下，荡涤胃肠积滞，为君药；木通上清心经之热，下则清利小肠，栀子清热泻火，为臣药；地黄凉血滋阴，为佐药；生甘草清热解毒，调和诸药，为使药。现收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第十九册，原质量标准仅包括性状、鉴别、检查、功能主治、用法用量、贮藏等项目，其中鉴别为大黄对照药材薄层色谱法[1]。原标准严重缺项，未能够有效控制药品质量，需要对其质量标准进行深入研究。肖培云等[2]曾经运用高效液相色谱法对小儿导赤片中大黄素和大黄酚进行含量测定研究，笔者对其方法进行验证，发现该方法重现性差且色谱峰的峰形和分离度等均达不到《中国药典》[3]方法学研究的要求，其样品测定结果仅为大理白族自治州中药制药有限责任公司1家企业样品，无法反映小儿导赤片的整体质量状况。为更好的保证药品质量，笔者重新建立高效液相色谱法对小儿导赤片中大黄素、大黄酚同时进行含量测定研究。

1 仪器、试药与样品

1.1 仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，检测器：SPD-20A(D2+W))；紫外分光光度计(岛津UV-2550)；分析天平(Denver TB-215D，十万分之一)；分析天平(SartorIUS BS224S，万分之一)

1.2 试药 对照品为大黄素(中国药品生物制品检定所，110796-201017，100%)、大黄酚(中国药品生物制品检定所，110756-200110，99.6%)；方法学研究用小儿导赤片样品均由云南白药集团丽江药业提供；甲醇由Merck公司生产，色谱纯；水为超纯水；磷酸为分析纯；乙酸乙酯、无水乙醇、95%乙醇、三氯甲烷等均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%磷酸水溶液(79：21)为流动相，检测波长为254 nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于2000。

2.2 对照品贮备溶液的制备 精密称取大黄素对照品5、09 mg，大黄酚对照品13.07 mg，置50 mL容量瓶中，加无水乙醇-乙酸乙酯(2：1)混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备溶液。对照品HPLC图谱见图1。

图1 对照品HPLC色谱图

2.3 供试品溶液制备 取小儿导赤片样品20片，精密称定重量，研细，精密加入95%乙醇25 mL，密塞，称定重量，置水浴上加热回流1 h，冷却，用95%乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取滤液10 mL至烧瓶内，置水浴上蒸干，残渣加30%的乙醇-盐酸(10：1)混合溶液15 mL，加热回流提取1 h，立即冷却，用三氯甲烷强烈振摇提取4次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯(2：1)混合溶液溶解，移至25 mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得。样品HPLC图谱见图2。

图2 样品HPLC色谱图

2.4 阴性供试品溶液制备 按处方量取缺大黄的其余药材模拟制剂工艺制备阴性样品，由云南白药集团丽江药业制备。取小儿导赤片缺大黄的阴性样品20片按2.3项下供试品溶液制备方法制备阴性供试品溶液。阴性样品HPLC图谱见图3。

图3 阴性样品HPLC色谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 分别精密吸取储备液，加无水乙醇-乙酸乙酯(2：1)溶液制成分别含大黄素浓度为4.072、8.144、10.180、20.36、30.54、40.72 μg/mL，大黄酚浓度为10.414、20.828、26.035、52.071、78.100、104.142 μg/mL的混合对照品溶液，分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。以对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，大黄素的回归方程为Y=38.6x+0.0362，r=0.9999，表明大黄素在4.072-40.72 μg/mL范围内线性关系良好；大黄酚的回归方程为Y=53.731x+5.8485，r=0.9999，表明大黄酚在10.414-104.142 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5.2 仪器精密度实验 取同一对照品溶液(大黄素浓度为10.180 μg/mL，大黄酚浓度为26.035 μg/mL)，按照2.1项下的液相色谱条件重复进样6次(n=6)，每次进样10 μL，大黄素和大黄酚峰面积的RSD值分别为0.03%与0.02%，均<2%，表明仪器的精密度良好。

2.5.3 稳定性实验 精密称取小儿导赤片细粉0.5008 g，按2.3项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL分别在室温下放置0、2、6、9、13、17 h后进样，按照2.1项下的色谱条件依法测定，大黄素和大黄酚的RSD分别为0.44%与0.50%，表明供试品溶液在17 h内基本稳定。

2.5.4 重复性实验 精密称取同一批次小儿导赤片样品细粉6份，按2.3项下供试品溶液制备方法处理后进行含量测定，按照外标法计算各样品中大黄素和大黄酚的含量，RSD值分别为1.83%和1.82%，说明重复性良好。

2.5.5 耐用性试验

2.5.5.1 提取溶剂的选择 取样品分别采用50%乙醇、50%甲醇、70%乙醇、95%乙醇进行提取，结果显示甲醇与95%乙醇的提取效果明显优于50%乙醇、50%甲醇、70%乙醇，而甲醇和95%乙醇之间无明显差别，且甲醇对人视觉有伤害，95%乙醇价格相对便宜，故选用95%乙醇。

2.5.5.2 提取方法与提取时间优化 比较超声提取30 min、超声提取1 h、回流提取30 min、回流提取1 h、冷浸12 h、冷浸24 h等提取条件，结果超声提取1 h、冷浸24 h、回流提取30 min的提取率明显低于回流提取1 h，故选择加热回流提取的方式进行提取；通过比较回流提取30 min、1、2 h等不同提取时间的提取效率，发现回流提取1 h与2 h的提取效果明显优于30 min，而提取1 h与提取2 h的提取效果基本无差别，表明回流处理1 h能提取完全。

2.5.5.3 色谱条件的优化 取样品溶液，分别采取不同比例的流动相进行测定，结果表明以甲醇-0.1%磷酸水溶液(79：21)为流动相时被测成分色谱峰的分离度及峰形较好；对不同品牌、不同规格的色谱柱及不同柱温进行优化测定，结果表明对被测成分色谱峰的分离度及测定结果无明显影响。

2.5.6 回收率试验 精密称取含量已知的小儿导赤片细粉6份，分别置于具塞锥形瓶中，分别精密加入大黄素、大黄酚对照品适量，按2.3项下供试品溶液制备方法及2.1项下的色谱条件依法测定含量并计算回收率，大黄素平均回收率为95.84%，RSD=0.62%；大黄酚平均回收率为96.40%，RSD=0.98%，表明该方法的回收率良好，结果见表1、表2。

2.6 样品测定 目前生产小儿导赤片主要有长春人民药业集团有限公司、大理白族自治州中药制药有限公司、广西天天乐药业股份有限公司、云南白药集团丽江药业有限公司等四家生产企业，为充分了解各家企业生产小儿导赤片的质量状况，课题组对4家企业共10批次样品进行含量测定研究，结果见表3。

表1 大黄素回收率结果

表2 大黄酚回收率结果

表3 样品含量测定结果

3 结果与讨论

3.1 本实验采用HPLC法同时测定小儿导赤片中大黄素、大黄酚的含量，该方法分离度好，灵敏度高且稳定性好，可作为其质量控制方法。

3.2 本实验对目前生产小儿导赤片的4家生产企业提供的样品进行测定研究，发现小儿导赤片的含量不仅在各家企业之间存在较大差距，而且同一企业生产的不同批次样品也存在一定差异，非常有必要对其质量标准进行提高研究。

3.3 大黄素在289 nm出现最大吸收峰，大黄酚在254 nm处有最大吸收，但验证发现254 nm处与289 nm处的吸收峰比较接近，样品溶液的信号响应值在254 nm时强于289 nm时，且其他成分在254 nm波长处测定无干扰，灵敏度较高，故测定波长选定为254 nm。

[1]中华人民共和国卫生部.药品标准中药成方制剂第十九册，1998，16.

[2]肖培云等.HPLC同时测定小儿导赤片中大黄素、大黄酚的含量[J]. 中成药，2008(30)，280.

[3]卫生部.中华人民共和国药典[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：231-232，22，附录130-131.

国家社会科学基金西部项目“彝族医药文化遗产保护与传承研究”(NO：12XMZ077)及2011-2012年度国家药品标准提高项目(NO：WX-11-83)资助。

徐士奎(1980～)，男，主管药师，药学博士，研究方向：彝族传统医药知识体系、质量标准、彝药资源学。

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1007-2349(2015)08-0074-03

2015-06-11)