加味宫外孕II号方对早孕大鼠滋养细胞凋亡因子Bax、Bcl-2的影响

郑文兰，杨江燕，谢 智，文晓敏

(1.贵阳中医学院第一附原医院，贵州 贵阳 550001；2.贵州省绥阳县中医医院，贵州 绥阳 550001)

加味宫外孕II号方对早孕大鼠滋养细胞凋亡因子Bax、Bcl-2的影响

郑文兰1，杨江燕2，谢 智1，文晓敏1

(1.贵阳中医学院第一附原医院，贵州 贵阳 550001；2.贵州省绥阳县中医医院，贵州 绥阳 550001)

目的 探索加味宫外孕Ⅱ号方对早孕大鼠滋养细胞凋亡因子Bax(促凋亡基因)、Bcl-2(抗凋亡基因)的影响。方法 将造模成功的早孕大鼠随机分为6组：西药组(甲氨蝶呤组)、中西药结合组(甲氨蝶呤和加味宫外孕Ⅱ号方)、中药加味宫外孕Ⅱ号方低、中、高剂量组和空白组(生理盐水)，分别给予甲氨蝶呤1次肌注、中药或生理盐水每天灌胃1次，连续7 d，用药后第8 d处死孕鼠取出其子宫及孕囊，用免疫组化法检测滋养细胞凋亡因子Bax、Bcl-2的表达。结果 5个实验组孕鼠滋养叶细胞Bcl-2评分降低，Bax评分升高，Bcl-2/Bax比值下降，与空白组比较均有差异(P<0.05)；而中西药结合组变化最明显，与其他几组比较有差异(P<0.05)，中药高、中剂量组、西药组间比较无差异，P>0.05，但与中药低剂量组比较有差异(P<0.05)。结论 加味宫外孕II号方和甲氨蝶呤均可通过降低妊娠大鼠滋养叶细胞的Bcl-2、升高Bax的表达，使Bcl-2/Bax比值下降从而促进细胞凋亡，达到杀胚的目的；且中西医结合效果最好，中药随剂量增加，杀胚作用逐渐加强。

加味宫外孕Ⅱ号方；滋养细胞；细胞凋亡；实验研究

异位妊娠是妇科常见的急腹症，发病率约为1%，并有逐年增加趋势[1]，严重者可引起患者失血性休克，甚至死亡，病死率占孕妇死亡总数的9 %～10 %[2]。本院多年来一直致力于异位妊娠中西医结合治疗的临床研究，取得较满意的治疗效果，实验研究结果表明，活血杀胚消癥中药可以通过改变早孕大鼠滋养细胞的超微结构、分泌功能、促使炎细胞浸润，致胚胎发育停滞而起杀胚作用[3]。邓高丕等研究提示：化瘀消癥中药可通过下调滋养叶细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，降低Bcl-2/Bax比值，从而促进滋养细胞凋亡的途径起到治疗输卵管妊娠的作用[4]。为探索本院治疗异位妊娠所用方(加味宫外孕Ⅱ号方)对滋养细胞凋亡的影响，本研究以早孕大鼠为模型，检测经加味宫外孕Ⅱ号方干预后的大鼠滋养细胞凋亡相关因子的表达，结果报道如下。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD大鼠共110只，性成熟未生育雌性大鼠80只(体重260±10)g；性成熟雄性大鼠30只(体重280±10)g；由第三军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK-(渝)2012-0005。

1.2 药物与试剂 加味宫外孕II号方组成：丹参15 g，桃仁9 g，赤芍15 g，莪术9 g，三棱9 g，全蝎10 g，土鳖虫10 g，蜈蚣9 g，紫草25 g；以上中药购于贵州省中医院；称取上药后，水煎、过滤、浓缩成每毫升各含生药6 g(高剂量)、3 g(中剂量)、1.5 g(低剂量)的3种药液，分别装瓶标记，置于4℃冰箱冷藏备用。注射用甲氨喋呤(MTX)，5 mg/瓶，生产批号H14022462，山西普德药业有限公司生产；鼠抗人Bcl-2单克隆抗体及鼠抗人Bax单克隆抗体均购自广州深达生物制品技术有限公司。

2 方法

2.1 动物模型制备 现有的文献资料未发现有建立异位妊娠动物模型的方法。本研究用早孕大鼠作为实验模型，造模方法参照《药理实验方法学》[5]。所有雌鼠连续行阴道脱落细胞涂片检查2周，剔除无动情周期雌鼠16只，入组有规律动情周期的雌鼠64只；将雄鼠与雌鼠按1：1比例合笼过夜，次日清晨取雌鼠阴道分泌物行光镜检查，如发现精子即为妊娠第1 d。

2.2 动物分组与给药 将交配成功的雌鼠随机编号分为6组：西药组、中西药结合组和中药低、中、高剂量组、空白组。经计算，每只大鼠加味宫外孕II号方给药剂量为0.777 mL/100 g/d，MTX给药剂量为0.7775mg/100 g。给药的时间为09：00-10：00。

2.2.1 西药组 妊娠第1 d按0.7775mg/100 g体重肌注MTX，1次为1疗程，以后不再给药，并同时按0.777 mL/100 g体重予生理盐水灌胃，1次/d。

2.2.2 中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组 妊娠第1 d按0.777 mL/100 g体重分别给予高剂量、中剂量、低剂量的加味宫外孕Ⅱ号方灌胃，1次/d。

2.2.2 中西药结合组 妊娠第1 d予中剂量加味宫外孕Ⅱ号方灌胃及MTX肌注。方法同西药组及中药中剂量组。

2.2.3 空白组 妊娠第1 d按0.777 mL/100 g体重予0.9%生理盐水灌胃，1次/d。中药及生理盐水灌胃均连续用7 d。

2.3 Bcl-2、Bax的检测

2.3.1 孕鼠妊娠子宫标本的采集 孕鼠第7 d晚8∶00开始禁饮食，次日8：00处死大鼠后迅速取出子宫并置于4%多聚甲醛固定24 h，制成石蜡切片。

2.3.2 Bcl-2、Bax的检测 将上述石蜡切片脱蜡、水化后采用免疫组化法检测滋养叶细胞凋亡因子Bcl-2、Bax的表达。严格按照Bcl-2、Bax试剂盒操作说明进行操作。Bcl-2、Bax诊断评分标准参照文献[6]拟定。随机选择10个高倍视野，计算阳性细胞的百分率，根据染色强度和阳性细胞百分数分为：在细胞内无棕黄色颗粒为阴性(-)记0分；在<50%的细胞内有棕黄色颗粒为弱阳性(+)记1分；在≥50%的细胞内有较浅的棕黄色或在<50%的细胞内有明显较深棕黄色颗粒为阳性(++)记2分；在≥ 50%的细胞内有明显较深的棕黄色颗粒为强阳性(+++)记3分。求每例10个高倍视野评分的平均值。

2.4 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件分析实验数据，P<0.05为差异有统计学意义

3 结果

3.1 滋养细胞Bcl-2表达评分 与空白组比较，5个实验组大鼠妊娠滋养叶细胞Bcl-2表达评分均下降，P<0.05；中西药结合组和中药高剂量组下降最明显，分别与另外3个实验组比较有差异，P<0.05；中西药结合组和中药高剂量组间比较无差异，P>0.05；西药组和中药中剂量组比较无差异，P>0.05；与中药低剂量组间比较有差异，P<0.05。详见表1。

表1 6组孕鼠滋养细胞Bcl-2表达评分的比较±s)

3.2 滋养细胞Bax表达评分及Bcl-2/Bax比值 与空白组比较，5个实验组大鼠滋养细胞Bax表达评分均有上升，P<0.05；而中西药结合组和中药高剂量组上升最明显，分别与另外3个实验组比较有差异，P<0.05；前2组间比较无差异，P>0.05，西药组与中药中、低剂量组间比较无差异，P>0.05。

Bcl-2/Bax比值：和空白组相比，另外5组Bcl-2/Bax比值均降低，P<0.05；其中中西药结合组与其他4个用药组比较有差异，P<0.05；中药高剂量组、中药中剂量组、西药组间比较无差异，P>0.05，但与中药低剂量组比较有差异，P<0.05。详见表2。

表2 6组孕鼠滋养细胞Bax表达评分及Bcl-2/Bax比值的比较

4 讨论

中医认为，异位妊娠的病机是少腹血瘀实证，其治则为活血杀胚消癥。本院以活血杀胚消癥法为立方依据拟定的经验方即加味宫外孕Ⅱ号方，方药组成：丹参、赤芍、桃仁、三棱、莪术、蜈蚣、全蝎、土鳖虫、紫草等。方中丹参有活血祛瘀、凉血消痈、除烦安神之功。赤芍具有清热凉血、消癥止痛的功效，桃仁有活血祛瘀推陈致新之功，三棱、莪术均有破血行气、消积止痛之功，蜈蚣、全蝎有攻毒散结、通络止痛之功。土鳖虫有破血逐瘀之功效，紫草长于凉血活血。全方共奏活血化瘀、杀胚消癥之功效。郑文兰等[3]研究认为该方可使早孕大鼠滋养叶细数量、超微结构及分泌功能发生明显变化，从而导致胚胎死亡。

细胞凋亡是由基因编码决定的细胞主动死亡，其启动和进程受一定程序的控制。其中抗凋亡蛋白 Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在细胞凋亡通路中起着重要的调节作用。Bcl-2/Bax蛋白的比值决定了细胞存活或凋亡，Bcl-2>Bax，细胞趋于存活；Bcl-2

[1]丰有吉，沈铿.妇产科学[M].北京：人民卫生出版社，2013：70-71.

[2]Berg CJ，Atrash HK，Koonin LM，et al.Pregnancy-related morality in the United States，1987-1990.Obstet Gynecol，1996，88(1)：161.

[3]郑文兰，赵春梅，杨江燕.活血杀胚消癥法对早孕大鼠妊娠滋养细胞影响的实验研究[J].云南中医中药杂志，2013，(10)：60-61.

[4]邓高丕，袁烁.化瘀消癥杀胚复方含药血清对体外培养输卵管妊娠滋养细胞凋亡的影响[J].中华中医药杂志，2012，27(4)：1003-1007.

[5]徐淑云，卞职濂，陈修，等.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，1991.1313-1314.

[6]张婷，吕东，王凤莲.细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2在子痫前期患者胎盘滋养细胞中的表达及意义[J].泰山医学院学报.2011，32(4)：264-266.

[7]王卫东.Bcl-2/Bax比率与细胞“命运”[J]。中国肿瘤生物治疗杂志，2007，14(4)：393-396.

郑文兰(1963-)，女，贵州人，研究方向：中西医结合妇科。

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1007-2349(2015)12-0073-02

2015-09-29)