正交试验优选雪上一枝蒿中乌头碱的提取工艺

曹红云，牛延菲，秦 波，刘开庆，游 燕

(云南省药物研究所，云南 昆明 650111)

正交试验优选雪上一枝蒿中乌头碱的提取工艺

曹红云，牛延菲，秦 波，刘开庆，游 燕△

(云南省药物研究所，云南 昆明 650111)

目的 优化雪上一枝蒿中乌头碱的提取工艺。方法 采用正交设计法考察料液比、乙醇浓度、提取时间3个因素对雪上一枝蒿中乌头碱提取率的影响，以HPLC法测定提取液中乌头碱的含量。结果 乙醇用量对试验结果有显著影响，其他因素影响不显著，最佳提取条件为3倍量70%乙醇渗漉提取8 d。结论 该方法稳定可靠，为工业化生产提供了理论依据。

雪上一枝蒿；乌头碱；提取；正交试验

1 仪器与试药

1.1 仪器及试剂 美国Agilent1100高效液相色谱仪(四元泵、DAD检测器、自动进样器、在线真空脱气机、智能化柱温箱及Agilent化学工作站)；N-1001型旋转蒸发仪；TC-6 KA型电子天平；DFY-500型粉碎机；SK-3200LH型超声清洗仪(180W，59kHz)；乙腈、四氢呋喃(色谱纯，默克公司)；其余为分析纯；水为云南省药物研究所自制超纯水。

1.2 试药 雪上一枝蒿药材购自昆明菊花园中药材市场，其产地为昭通，经云南省药物所究所天然药物资源研究中心正高级工程师高丽鉴定为短柄乌头AconitumbrachypodumDiels的干燥块根。乌头碱对照品(中国食品药品生物检定所，纯度为98.8%)。

2 方法与结果[5-7]

2.1 色谱条件 色谱柱 Shiseido MGⅡC18，4.6×250 mm，5 μm(日本 资生堂)；以乙腈：四氢呋喃(25：15)为流动相A，以0.1 mol/L醋酸铵溶液(每1000 mL加冰醋酸0.5 mL)为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为235 nm。理论板数按乌头碱峰计算应不低于3000。乌头碱对照品HPLC图见图1。

表1 梯度洗脱程序

A—空白对照;B—乌头碱对照;C—样品;D—样品+乌头碱对照

图1 乌头碱对照品HPLC图

2.2 对照品溶液的制备 取乌头碱对照品适量，精密称定，加二氯甲烷制成每1 mL含乌头碱0.2 mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 精密量取提取液10 mL，置圆底烧瓶中，50℃减压浓缩，加氨试液3 mL，精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1：1)混合溶液50 mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz；水温在25℃以下)30 min，放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯(1：1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加二氯甲烷溶解定容于5ml容量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系的考察 分别精密称取乌头碱对照品

图2 乌头碱线性关系图

10.05 mg，置50 mL容量瓶中，加二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，制得乌头碱浓度为0.1986 mg/mL的对照品储备溶液，精密吸取以上储备液，按“2.1”项色谱条件进样，进样量分别为1、2、5、10、15、20、30 μL，记录峰面积。以含量(X)对峰面积(Y)进行线性回归，得乌头碱回归方程：Y=1383.4X-25.738，相关系数r=0.9998。结果表明，在上述色谱条件下，乌头碱在0.1986μg-5.9580μg范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取乌头碱浓度为0.1986 mg/ml的对照品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，进样量10μl，连续进样6针，以峰面积计算，算得RSD=1.8%(n=6)，结果表明本法具有良好的仪器精密度。

2.6 稳定性试验 取已制备好的供试品溶液按“2.1”项色谱条件，分别于0、6、8、12、24 h进样，进样体积10 μL，以峰面积计算，结果RSD=1.9%(n=5)，所得的样品中乌头碱含量基本一致，说明样品在24 h内稳定。

根据PT中所得到的位置和距离信息，按照第1.3节中的方法，得到每个区域内点，以每个区域内点到原点(目标船)距离为指标，将距离分为若干区间，分别统计各个区间内出现的频次和频率。将每个区间中点值作为该区间的值，以频率近似替代样本概率。假设目标船到周围最近船舶的距离分布是连续的，利用MATLAB曲线拟合工具箱CFtool对区间上系列点及其概率进行拟合，即可得到每个区域内目标船到周围船舶的距离的概率密度分布函数f(D)。

2.7 重复性试验 精密量取同一批次的样品6份，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备，按“2.1”项色谱条件进样，进样量10 μL，测定乌头碱含量。计算得RSD=1.7%(n=6)，结果表明本法具有良好的重复性。

2.8 加样回收率 精密量取6份已知乌头碱含量的供试品，每份5 mL，分别加上述混合对照品溶液0.5 mL，然后按“2.3”项下供试品溶液制备方法同法处理，将处理好的供试品溶液按“2.1”项色谱条件进样，进样量10 μL，测定。计算回收率，结果表明，该分析方法的乌头碱回收率为96.37%～102.00%，RSD值为2.3%(n=6)。试验结果表明，回收率良好。

3 正交试验

3.1 试验设计 以A：乙醇用量(药材量倍数)、B：乙醇浓度、C：提取时间作为考察因素，用L9(34)正交试验方案，试验设计见表2。

表2 因素水平表

3.2 提取液制备 将雪上一枝蒿药材粉碎为粗颗粒，称取200 g，投入渗漉罐中，按正交设计方案，用乙醇溶剂均匀润湿，密闭放置1 d后，开始渗漉提取，制备得提取液。

3.3 乌头碱含量测定 按“2.1～2.3”项下的HPLC法对提取液进行乌头碱含量测定，结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 L9(34)正交试验直观分析结果

表4 L9(34)正交试验方差分析结果

注：F0.05(2，2)……19

实验结果直观分析表明：影响乌头碱提取的因素大小依次是A>C>B。方差分析结果表明，乙醇用量对乌头碱的提取有显著性影响(P<0.05)，提取时间、乙醇浓度的影响不大。从实验结果可得出最佳提取工艺为A3B2C3，即优选工艺为每天3倍量70%乙醇渗漉提取8天。

4 工艺验证试验

取5批雪上一枝蒿药材各200 g，按照正交设计优选工艺，即用3倍量70%乙醇渗漉提取8 d，提取液按“2.1～2.3”项下处理，测定乌头碱含量，其提取率分别为63.8%、67.6%、65.8%、63.9%、64.5%。

5 讨论

雪上一枝蒿为毒性药材，其乌头碱的口服中毒量一般为0.2mg，致死量为3～5mg[8]，在制剂入药时要慎重其用量。如在处方用量一定的情况下，可考虑将药材进行水泡、水煮、甘草制、油制、童尿制、醋制等炮制方法使其毒性降低[9]。雪上一枝蒿制剂多为外用，主要有消肿止痛的功效。现代研究表明，雪上一枝蒿中所含乌头碱具有显著的抗炎、抗肿瘤、镇痛、局麻等活性[10-12]，其镇痛机理主要是乌头碱抑制神经干中神经冲动的传导或使神经干完全丧失兴奋和传导的能力[12]。如经炮制，其毒性降低的同时药效也会大大降低，所以这就要求对制备工艺进行优化，将乌头碱量控制在一个安全有效的范围内。

试验中参考了2010年版《中国药典》一部草乌含量测定项下的检测方法进行了摸索试验，确定了高效液相色谱法测定雪上一枝蒿提取液中乌头碱的方法，方法学验证试验表明，该方法准确可行，重复性好，可用于雪上一枝蒿提取液中乌头碱检测。由于雪上一枝蒿中次乌头碱和新乌头碱含量较低，所以试验中仅选择乌头碱为提取工艺评价指标。

由试验结果可知，影响乌头碱提取的主次因素为：A>C>B，最佳提取工艺为A3B2C3，即3倍量70%乙醇渗漉提取8 d。根据筛选得到的最佳工艺提取5批样品，平均提取率为65%，RSD=2.46%(n=5)，进一步验证该工艺稳定可行，具有较好的重复性。

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曹红云(1983-)，女，硕士，工程师，主要从事中药分析。E-mail：caohy612@163.com。

△通信作者：游燕，E-mail：youwanyan@sohu.com

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