围绝经期综合征肝郁大鼠模型的建立及评价*

沈建英 丁珊珊 赖新梅 杨小婷 柯龙 林开敏 杨敏

围绝经期综合征指妇女绝经前后由于性激素波动或减少所致的一系列躯体及精神心理症状，其中雌激素水平下降是引起该病的主要原因[1-2]。随着生活水平提高，工作压力加大，人口老龄化加剧，围绝经期综合征的发病率逐年增高。肝气郁结证是其主要中医证型，中医药治疗已经取得较好的疗效，而且副作用小[3-4]。目前比较认可的围绝经期综合征肝郁模型是运用自然衰老的大鼠进行造模，然而由于其饲养周期长，成本高，来源非常稀少，因此相关的研究报道相对较少，中医药对其作用机制的了解受到很大的局限[5-6]。而去势大鼠也是公认的围绝经期综合征模型，其阴道脱落细胞涂片及血清性激素水平均和围绝经期发生的改变相似[7-8]。因此本研究拟用去势大鼠模型，联合慢性束缚应激与孤养法进行造模，从外观特征及行为学水平来探讨该模型的有效性，为进一步探讨中医药治疗围绝经期综合征肝郁的科学内涵提供基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 健康雌性SD大鼠24只，体质量（220±20）g，清洁级，动物许可证号为SCXK （京） 2002-2009，由福建中医药大学实验动物中心提供。光/暗周期为12 h/12 h（光照时间6：00-18：00），室温（22±2）℃，相对湿度保持为30%~40%，喂常规颗粒饲料及饮用水。适应性饲养两周后，利用敞箱实验对每只大鼠进行行为学评分，水平运动和垂直运动总得分低于40分和高于160分的动物予以剔除，选择各项行为学指标得分相近的24只大鼠，按体质量分层采用随机数字表法将大鼠随机分为假手术组、去势空白组、去势模型组，每组各8只，组间体质量及旷场评分比较差异无统计学意义（P<0.05）。

1.2 模型的建立 （1）去势：动物分组后行去卵巢手术。手术前，两组大鼠均禁食12 h，按体质量腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，模型组从腹部正中线切口，切除双侧卵巢，假手术组不切除卵巢，只将卵巢旁与卵巢等大的一块脂肪组织切除。动物手术后自然修复两周，在慢性束缚应激前进行连续5 d阴道涂片检测，观察无成熟脱落细胞，证明卵巢切除完整，造模成功。假手术组动物的阴道脱落细胞依然呈典型的周期性变化。（2）慢性束缚：用慢性束缚应激结合孤养法建立肝郁证大鼠模型，将去势模型组大鼠置于束缚筒内，管壁有若干通风口，通风良好，大鼠能够自由呼吸，束缚应激时间为6 h（9：00-15：00），连续束缚21 d，束缚应激期间禁食禁水。假手术组和去势空白组在同一时段内也是禁食禁水。（3）孤养：去势模型组单笼饲养，假手术组和去势空白组群养，4只/笼。

1.3 体质量与行为学检测

1.3.1 外部特征及体质量 每天造模前观察并记录各组大鼠的饮食、二便、毛发色泽、情绪行为等外观方面的变化。分别于手术前1天，应激前1天，应激第7、14、21天上午8：00-9：00记录各组大鼠体质量。

1.3.2 旷场实验 于动物分组前、应激前1天和应激第21天8：00-12：00进行测试。采用自制长×宽×高=75 cm×75 cm×40 cm的敞箱，底面划分成25个面积相等的方格。旷场的中央放一彩色瓶子激发大鼠的好奇心。拍摄并记录5 min内大鼠的水平运动格数（四爪皆进入记为1分）和垂直竖立次数（两前爪腾空或攀附箱壁记为1分）。每只大鼠均从同一角落放入，测评结束后，及时记录粪便颗粒数，并用75%酒精擦拭以消除气味的影响，待酒精晾干后再进行下一次实验。

1.3.3 糖水偏好实验 分别在分组前、造模前和造模结束后检测各组大鼠的糖水消耗率。按照文献[9]的方法进行部分修改，实验进行时，每只大鼠单笼喂养，实验前，训练实验大鼠适应含糖饮水12 h（20：00-次日8：00），10 h禁食禁水后，同时给予1%蔗糖水和纯水各1瓶，1 h后调换蔗糖水和纯水的位置，2 h后分别称量纯水消耗量及蔗糖水消耗量，计算糖水消耗率（糖水消耗率=糖水消耗量/总液体消耗量×100%）。

1.4 统计学处理 使用SPSS 19.0软件，计量资料采用（±s）表示，对所得一般性数据做正态分布检验和组间方差齐性检验，其中体质量、糖水消耗率、旷场实验的水平得分及垂直得分符合正态分布和方差齐性，用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验进行分析；旷场实验中的修饰得分、粪便数目不符合正态分布则采用采用非参数检验进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组外部特征及体质量变化比较 造模前，各组大鼠活泼好动，皮毛光泽好、粪便呈球形。造模结束后，大鼠毛发变得干枯、胡须下搭、行动迟缓、精神倦怠、嗜卧、进食进水量减少、大便稀软。各组大鼠在行去势手术前体质量比较差异无统计学意义（P>0.05）。去势后两周即应激前1天，与假手术组相比，两个去势组的大鼠体质量均显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）。于应激第7、14、21天，和去势空白组相比，去势模型组的体质量均显著下降，两组比较差异有统计学意义（P<0.01）；应激第21天，去势模型组的体质量甚至低于假手术组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表 1。

2.2 三组对旷场行为的影响比较 手术前，各组大鼠在基线水平的水平得分和垂直得分差异均无统计学意义（P>0.05）；手术后两周，即应激造模前1天，和假手术组比较，去势空白组和去势模型组大鼠的水平活动得分均有显著下降（P<0.01）；应激造模结束后，与假手术组相比，去势空白组和去势模型组大鼠的水平活动得分均进一步显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）。在垂直得分的分析结果中发现，仅去势模型组大鼠在应激结束后，其得分和假手术组及去势空白组相比发生显著性下降，差异有统计学意义（P<0.01），见表2。各组大鼠的修饰次数和粪便颗粒经秩和检验，差异均无统计学意义（P>0.05），但是去势模型组的修饰次数有减少的趋势，粪便颗粒数有增加的趋势（数据未列出）。

表1 慢性束缚应激对各组大鼠体质量的影响（x-±s） g

表2 慢性束缚应激对各组大鼠旷场行为的影响比较（x-±s） 分

2.3 各组对糖水偏好的影响比较 手术前，各组大鼠在基线水平的糖水消耗率比较差异无统计学意义（P>0.05）；手术两周后，即应激造模前，和假手术组比较，去势空白组和去势模型组的糖水消耗率均明显下降，差异均有统计学意义（P<0.05）；应激造模结束后，和假手术组相比，去势空白组与去势模型组糖水消耗率均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01），去势模型组的糖水消耗率显著低于去势空白组，两组比较差异有统计学意义（P<0.01），见表3。

表3 慢性束缚应激对各组大鼠糖水偏爱率的影响（x-±s）%

与假手术组比较，*P<0.01，**P<0.05；△与去势空白组比较，P<0.01

3 讨论

课题组前期研究结果表明，肝郁是围绝经期综合征的重要病理因素[4]。围绝经期女性常面临家庭及事业等多种问题，精神压力较大，多感所愿不遂、抑郁于内，易形成心理应激。因此，建立围绝经期综合征肝郁动物模型对于本病机理的深入研究具有一定的现实意义。本文通过手术摘除卵巢人为地造成雌激素突然下降模拟围绝经期综合征的状态，该方法周期短、简单易行，是常用的一种围绝经期综合征造模方法[8]。目前普遍认为，肝郁多表现为认知、人格等心境障碍，病理反应涉及植物神经功能紊乱，神经内分泌免疫等调节网络的失衡[10]。多数学者认为，肝主疏泄的功能与心理—应激反应有关，从心理—应激反应来研究肝郁是近几年的研究热点[11-12]。慢性束缚应激使动物自由行动受限，情绪受抑，比较接近中医“情志不遂”致郁的发病学说；孤养则模拟了人类远离社会、家庭的生存状态，运用束缚制动联合孤养法建立肝郁大鼠模型，可以制造较为纯粹的挫折应激和孤独感受，是较好的负性心理应激动物模型[13-14]。另外，因其躯体应激因素较小，对机体无损伤性刺激，与人类身心性疾病的致病过程类似，近年来在肝郁相关研究中已被广泛采用[15-16]。本研究表明，去势模型组大鼠体重增加缓慢，探究行为减少，表现出情绪低落、兴趣减退等症状，与围绝经期综合征肝郁证的形成过程相似。

围绝经期女性由于卵巢萎缩，雌激素分泌下降，糖和脂肪代谢发生紊乱，体脂分布异常，特别是腹内脂肪积聚[14]。在本研究中大鼠在去势手术后两周体质量显著增加，该现象与女性在围绝经期的体质量变化相吻合。在束缚应激条件下，肾上腺皮质醇显著升高，机体对胰岛素的敏感性增加，皮质醇还可以促进蛋白质分解，抑制其合成，同时影响糖和脂类的代谢[17]。因此本研究中去势模型组在应激开始后，体质量几乎没有增长，甚至有下降的趋势。

在行为学研究中，旷场实验可以用来检测动物在新奇环境中的活动度、探究行为、恐惧紧张状态及警觉性，其中水平活动反映动物的活动度，垂直活动反映动物对新鲜环境的好奇程度，粪便粒数是大鼠紧张程度的表现[18]。肝气郁结证核心症状之一是“快感缺失”，糖水偏好实验则是用来检验动物对幸福事件反应能力的变化，糖水消耗量及偏嗜度降低，表明动物对奖励敏感度低，常作为一项反映动物愉悦体验能力的指标[19-20]。本研究表明，大鼠在去势后，水平运动得分及糖水消耗率明显下降，在慢性束缚应激结合孤养的作用下，去势模型组大鼠的行为活动进一步减少、糖水消耗率进一步降低，提示仅仅去势即会使大鼠活动度、好奇程度及奖赏反应的敏感度下降，但是肝郁造模后大鼠的各症状加剧，快感缺乏，兴趣丧失，可能是由于大鼠卵巢切除后，生殖内分泌功能开始衰退，对抗应激损伤的能力降低，脑内奖赏系统的一些神经元发生结构性损伤所致。

综上所述，采用去势及慢性束缚应激联合孤养三步法复合制作围绝经期综合征肝郁大鼠模型，可以有效地模仿女性围绝经期由于卵巢功能衰退引起的情感障碍、情绪低落的临床表现。但是值得注意的是，在研究过程中发现，慢性应激诱导行为改变的易感性存在较大的个体差异，该方法并不能实现百分之百的成功率，因此研究过程中，必须适当增加样本例数[21]。另外，围绝经期综合征肝郁的病理机制涉及神经内分泌免疫等调节网络，运用现代分子生物学技术进一步阐明其发生发展机制，将为围绝经期综合征肝郁的临床治疗提供理论基础。

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