正交设计－重复试验优选桔皮精油的酶解提取工艺*

王建美 ，宋焕春 ，陈 菲

（1.金华职业技术学院，浙江 金华 321007； 2.浙江省金华市中心医院，浙江 金华 321000）

桔皮是芸香科植物柑橘属桔类和柑类的成熟果皮。我国是世界上柑橘种植面积和产量最大的国家，主要种植地为浙江、福建、湖南等地区，其中浙江衢州被农业部命名为“中国 柑之乡”，柑栽培历史有1 400多年[1]。桔皮产量约占柑橘产量的20%～40%，但其在柑橘加工生产时常被当作废弃物处理。桔皮中含有1% ～3%的精油[2－3]，是食品、日化用品和香水等的优质原料[4－5]，提取桔皮精油可使柑橘类产品得到进一步的利用，提高其附加值[6]。目前，桔皮精油的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、纤维素酶解法、萃取法、超声波提取法、压榨法等，各有优劣。复合酶法辅助提取桔皮精油的工艺未见文献报道。果胶酶是使细胞间的果胶质降解，转化为可溶性的果胶，从而把细胞从组织内分离出来；纤维素酶是通过破坏细胞壁的骨架结构，极大地减少传质屏障对有效成分扩散的阻碍，增加活性成分从植物细胞内溶出，从而提高得率[6－7]。由于单因素考察不能反映各因素间的相互作用，本研究中以正交设计－重复试验的方法对相关工艺参数进行优选，采用复合酶法辅助水蒸气蒸馏法的提取工艺，以桔皮精油的得率为考察指标，为复合酶－水蒸气蒸馏法提取桔皮精油的规模化生产及推广应用提供理论支持。

1 仪器与试药

HH－2型数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；101型电热恒温干燥箱（中国龙口市先科仪器公司）；GX－8型高效粉碎机（江阴市骏朗机械设备有限公司）；恒温水浴锅（杭州蓝天化验仪器厂）；SB30001型电子天平（上表电子仪器厂）。浙江省衢州市产柑橘（经浙江省金华职业技术学院施淑琴中药师鉴定为Citrus reticulata Blanco cv.Reticulata)剥离得到的桔皮；纤维素酶（10 万 U /mL）、果胶酶（3 万 U /mL）均购于柏汉森（山东）生物科技有限公司；无水乙醚、氯化钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取工艺考察

预处理：将新鲜桔皮在40℃用恒温干燥箱烘干，干桔皮用高效粉碎机粉碎，过30目筛[8]备用。

提取工艺：水蒸气蒸馏法[9－10]并辅以复合酶酶解提取桔皮精油。准确称取25 g已预处理的碎桔皮，放入圆底烧瓶中，加复合酶（纤维素酶和果胶酶）适量，再加蒸馏水50 mL，搅匀，调节pH，设定温度后，在恒温水浴锅中酶解一定时间，装上水蒸气蒸馏装置，蒸馏，收集馏分，向其中加入适量30 g/L的氯化钠，静置，过滤，滤液用无水乙醚萃取2次，然后向萃取液中加适量无水硫酸钠，放置过夜，回收乙醚即得桔皮精油产品，称重。每项试验平行操作3次。

考察指标：桔皮中精油得率，计算公式为，精油得率(%)＝[最后得到的精油量（g） /桔皮的原料量（g）]× 100% 。

2.2 正交试验优选

根据桔皮精油的性质、实际操作要求和单因素试验结果，拟订影响桔皮精油得率的4个主要因素，即因素A（果胶酶与纤维素酶配比）、因素 B（酶解温度）、因素C（蒸馏时间）和因素 D（pH）作为优选因素，进行 L9（34）正交试验。因素水平见表1，正交试验结果见表2。采用SPSS 19.0软件对正交试验数据进行统计分析，组间比较行 t检验。P＜0.05为具有显著性差异。方差分析结果见表3。由表2可见，极差 R值大小显示，不同因素对桔皮中精油得率的影响程度为 D＞C＞B＞A；由表3可见，因素 B，C，D的影响具有显著性意义，A因素的影响无显著性意义。由表2和表3可知，4个因素的最优组合为A2B1C3D2，即用果胶酶与纤维素酶配比（U /U）1∶2，pH 为 4，50℃下酶解，然后蒸馏 3 h的精油得率最高。其中酶解温度50℃与研究[6]中酶解温度对桔皮中精油得率的影响相一致。

表1 正交试验设计 L9(34)因素水平表

表2 L9(34)正交试验结果

表3 L9（34）正交试验结果方差分析

2.3 验证试验

对正交试验筛选得到的最优提取工艺A2B1C3D2，与正交设计中的最优方案A3B1C3D2进行比较，同时考虑正交试验显示因素A对桔皮精油得率影响程度最小，为了验证复合酶对提取是否有促进作用，采用不加酶、最佳条件A3B1C3D2与最优提取工艺A2B1C3D2进行对比验证。结果见表4。可见，A2B1C3D2与A3B1C3D2间无明显差别；而是否加酶对桔皮中精油的得率有显著性影响，加复合酶使桔皮精油得率增加了28.99%。综合以上因素，A2B1C3D2提取工艺条件理想，结果稳定、合理。

表4 最优工艺验证试验结果及比较

3 讨论

复合酶酶解辅助水蒸气蒸馏的方法提取桔皮中的精油与单一水蒸气蒸馏法相比得率高。其原因可能是桔皮中不仅有大量纤维素，也存在一些果胶成分，故纤维素酶与果胶酶联合使用效果好。

由预试验确定因素及其水平范围，进行复合酶酶解辅助水蒸气蒸馏法提取桔皮中精油的正交试验，为减少方法误差和操作误差等对试验结果的影响，采用正交设计－重复试验以优化提取工艺，获得最优条件是：果胶酶与纤维素酶配比为1∶2，pH＝4，50℃，蒸馏时间 3 h。采用此工艺条件，桔皮中精油的得率是2.18%，其中各因素的影响顺序是D＞C＞B＞A。

由表2可知，正交试验表 L9(34)各列均被因素排满，且没有误差列，也无相关信息提供经验误差。为了避免增加试验次数和使用更大的正交表，故采用重复试验的方法来估算试验误差，进行正交试验的方差分析。1

参考文献：

[1]衢州旅游网 .衢州 柑[EB /OL].[2014－08－01].http://www.okquzhou.com /qzgw /qztc /62.html.

[2]陈林林，米 强，辛嘉英.柑橘皮精油成分分析及抑菌活性研究[J].食品科学，2010，17（31）：25－28.

[3]Sawamura M，Shichiri K，Ootani Y，et al.Volatile Constituents of Several Varieties of Pummelos and Characteristics Among Citrus Species[J].Agric Bio Chem，1991，55(10):2 571－2 578.

[4]石桂凤，朱玉昌.柑橘皮综合利用的实用技术[J].食用工业科技，1989（5）：41－45.

[5]刘 涛，谢功目匀.柑橘类精油的提取及应用现状[J].包装与食品机械，2009，27（1）：44－48.

[6]王建美，罗玲环，吴梦霞，等.酶解－水蒸气蒸馏法提取桔皮精油的工艺研究[J].金华职业技术学院学报，2013，13（6）：86－89.

[7]尹永芹，沈志滨.中药化学成分提取分离方法的研究进展[J].中国药业，2012，21（2）：19－21.

[8]邵伶俐，蔡淑萍.柑橘皮中精油的提取工艺优化[J].广东化工，2012，39（9）：92－93.

[9]赵其阳，焦必宁，付陈梅，等.柑桔皮及其果汁中香精油含量的蒸馏滴定方法研究[J].中国南方果树，2006，35（5）：9－11.

[10]徐 宁，谭兴和，王 锋，等.减压蒸馏分离柑桔皮精油中柠檬烯的研究[J].食品工业科技，2013，35（2）：222－225.