乌骨藤总苷对SGC－7901、S180、P388肿瘤细胞的抑制作用研究

林耀才

(广州医科大学附属深圳沙井医院，广东 深圳 518104)

乌骨藤为萝藦科通关藤［Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wight et Arn.］的藤茎，性味苦，微寒，归肺经，具有止咳平喘，祛痰，通乳，清热解毒等功效［1］。民间草医常用于治疗原发性肝癌等消化系统肿瘤，具有一定的疗效，且安全性较好。以其为原料制备的消癌平制剂广泛用于肝癌、胃癌、食管癌、肺癌等肿瘤的治疗［2～6］，具有疗效好、毒性低的特点，可提高患者机体免疫力，改善晚期肿瘤患者的生存质量，延长患者生存时间。乌骨藤含有甾体苷、生物碱、有机酸、多糖、树脂及色素等化学成分，临床用消癌平口服制剂均采用乌骨藤总提物入药，存在服药量大的不足。现代药理分析表明甾体总苷可能是其辅助抗癌的主要成分，本文研究乌骨藤总苷对SGC－7901、S180、P388肿瘤细胞的抑制作用，为开发乌骨藤组分中药抗癌新药奠定基础。

1 材料

1.1 药物 乌骨藤总苷(自制，C21甾体苷类成分含量＞50%，批号:20130812);5－氟胞嘧啶注射液(天津金耀氨基酸有限公司，10 mL(0.25 g)/支，批号:1305052);羟喜树碱注射液(黄石飞云制药有限公司，2 mL(2 mg)/支，批号:130801);注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，0.2 g/支，批号:13011025)。

1.2 瘤株细胞 人胃癌细胞株SGC－7901细胞株、小鼠肉瘤S180细胞和淋巴白血病细胞P388细胞均购自中国科学院上海分院细胞生物研究所。

1.3 动物 SPF级昆明小鼠，雌雄各半，18～22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号:SCXK(湘)2013－0004。Balb/c裸鼠，雌雄各半，18～22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号:SCXK(湘)2013－0004。DBA/2小鼠，雌雄各半，18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号:SCXK(沪)2012－0002。

1.4 仪器 超净工作台(苏州净化设备公司);细胞培养箱(美国SHEL－LAB公司);酶标仪(美国Bio－Rad公司)。

2 方法

2.1 对人胃癌细胞SGC－7901的体外抑制试验乌骨藤总苷组设高、中、低3个剂量组(剂量分别为15、12、9 mg·mL－1)，阳性对照组使用羟喜树碱(剂量为0.001 mg·mL－1)，空白对照组给予生理盐水，每组设10个复孔。取对数生长期的SGC－7901细胞，计数，采用RPMI－1640培养液配置细胞悬液(细胞数2.0×105·mL－1)，将上述细胞液加入96孔板，置37℃的CO2培养箱中，加入MTT液，连续作用7 d，测定A值，计算各试验组对SGC－7901细胞的抑制率。

抑制率=(对照组A540－治疗组A540)/对照组A540×100%

2.2 对人胃癌细胞SGC－7901的体内抑制实验乌骨藤总苷组设高、中、低3个剂量组(剂量分别为240、180、120 mg·kg－1)，阳性对照组使用 5 － 氟胞嘧啶(剂量为0.025 mg·kg－1)，空白对照组使用生理盐水，各组均采用腹腔内注射方式给药。取SGC－7901细胞(处于对数生长期)离心5 min(转速1000 rpm)，然后浓缩至1 mL(含细胞4×107个)，先后加入纤维蛋白原和凝血酶液使之形成细胞凝块，将其分割成等体积小块。接种Balb/c裸鼠于前1 d腹腔内注射环磷酰胺150 mg·kg－1，将瘤体接种于裸鼠肾囊下，瘤体移植后第2天开始连续给药7 d，第8天将小鼠处死，测量肿瘤长径和短径，并计算肿瘤体积和肿瘤抑制率。

肿瘤体积=长径×短径×短径/2［7］

肿瘤抑制率=(对照组肿瘤体积－用药组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100%

2.3 对小鼠移植肉瘤S180的抑制作用 取6只健康昆明小鼠，雌雄各半，腹腔注射液体石蜡油(0.5 mL/只)，7天后于小鼠腹腔接种S180细胞(0.5 mL/只)，接种后9 d断颈处死小鼠，于无菌条件下取出腹水，用RPMI1640培养基洗涤2次后制成细胞悬液，于实验小鼠腋窝皮下接种0.2 mL(1×106个瘤细胞)细胞悬液，每批接种50只，接种后次日随机分组，每组10只，乌骨藤总苷组设高、中、低3个剂量组(剂量分别为 540、270、135 mg·kg－1)，阳性对照组给予环磷酰胺(剂量为25 mg·kg－1)，空白对照组使用生理盐水，各组均采用灌胃方式给药，每天1次，连续10 d，于末次给药后处死小鼠，称体重，摘瘤称重，计算抑瘤率。

2.4 对小鼠移植淋巴白血病细胞P388的抑制作用按常规方法［7］接种P388细胞悬液于DBA/2小鼠腹腔，每只小鼠接种0.2 mL(1×106个瘤细胞)，接种后次日随机分组，每组10只，乌骨藤总苷组设高、中、低3个剂量组(剂量分别为540、270、135 mg·kg－1)，阳性对照组给予环磷酰胺(剂量为50 mg·kg－1)，空白对照组使用生理盐水，各组均采用灌胃方式给药，每天1次，连续10 d，记录小鼠生存时间，计算生命延长率。

2.5 统计 统计方法采用两组标本计量资料的t检验。

3 结果

3.1 对人胃癌细胞SGC－7901的体外抑制试验乌骨藤总苷对SGC－7901细胞的抑制率呈剂量依赖关系，与空白对照组差异明显:乌骨藤总苷高剂量组与空白对照组比较P＜0.001，乌骨藤中剂量组与空白对照组比较P＜0.01。乌骨藤总苷高剂量组抑制率与羟基喜树碱组相当，乌骨藤总苷组中低剂量组抑制率显著弱于羟基喜树碱，结果见表1。

表1 乌骨藤总苷对SGC－7901胃癌细胞生长抑制作用(，n=10)

表1 乌骨藤总苷对SGC－7901胃癌细胞生长抑制作用(，n=10)

注:与空白对照组比较，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001;与羟喜树碱组比较，##P＜0.01

组别 药物浓度(mg·mL－1) A540 抑制率(%)98乌骨藤总苷组空白对照组0.76 ±0.05 －15 0.03 ±0.02＊＊＊－9412 0.33 ±0.03＊＊ 58##90.58 ±0.09 26##羟喜树碱组 0.001 0.01 ±0.01＊＊＊

3.2 对人胃癌细胞SGC－7901的体内抑制实验腹腔内注射乌骨藤总苷对肿瘤的抑制率呈剂量依赖关系，各用药剂量组的抑瘤率与空白对照组比较有显著差异:乌骨藤总苷高剂量组与生理盐水组比较P＜0.01，乌骨藤中剂量组与空白对照组比较P＜0.01，乌骨藤低剂量组与空白对照组比较P＜0.05。乌骨藤总苷高剂量组抑瘤率与5－氟胞嘧啶组相当，乌骨藤总苷组中低剂量组抑瘤率显著弱于5－氟胞嘧啶组。乌骨藤甾体总苷各组给药后体重和毛色均无明显改变，结果见表2。

表2 乌骨藤总苷对小鼠SGC－7901胃癌细胞的生长抑制(，n=10)

表2 乌骨藤总苷对小鼠SGC－7901胃癌细胞的生长抑制(，n=10)

注:与生理盐水组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与5－氟胞嘧啶组比较，##P＜0.01

组别 剂量(mg·kg－1) 肿瘤体积 抑制率(%)生理盐水组10±3120 6±3* 49##乌骨藤总苷组78180 4.8 ±2.1＊＊ 54##240 2.7 ±2.1＊＊ 725 －氟胞嘧啶 0.025 2.5 ±1.4*

3.3 对小鼠移植肉瘤S180的抑制作用 结果表明，乌骨藤总苷对小鼠移植肿瘤S180有明显抑制作用，与对照组比较具有显著差异:乌骨藤总苷高剂量组与生理盐水组比较P＜0.01，乌骨藤中剂量组与空白对照组比较P＜0.01，乌骨藤低剂量组与空白对照组比较P＜0.05。乌骨藤总苷高中低剂量组抑瘤率显著弱于环磷酰胺组，结果见表3。

表3 乌骨藤总苷对小鼠移植S180的抑制作用，n=10)

表3 乌骨藤总苷对小鼠移植S180的抑制作用，n=10)

注:与对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001;与环磷酰胺组比较，##P＜0.01

组别 剂量(mg·kg－1) 肿瘤重量(g) 抑瘤率(%)对照组1.88 ±0.45540 1.18 ±0.52＊＊ 36.25##乌骨藤总苷组80.11270 1.10 ±0.61＊＊ 40.18##135 1.29 ±0.55* 30.78##环磷酰胺 25 0.75 ±0.36＊＊＊

3.4 对小鼠移植淋巴白血病细胞P388的抑制作用 结果表明乌骨藤总苷对小鼠移植P388有显著抑制作用，使小鼠生存时间延长，与对照组比较差异显著:乌骨藤总苷高剂量组与生理盐水组比较P＜0.01，乌骨藤中剂量组与空白对照组比较P＜0.01，乌骨藤低剂量组与空白对照组比较P＜0.05。乌骨藤总苷高中低剂量组生命延长率显著弱于环磷酰胺组，结果见表4。

4 讨论

乌骨藤含有多种甾体苷、生物碱、有机酸、多糖、树脂及色素等化学成分［8～10］，研究表明C21甾体苷具有明显的抗肿瘤、免疫调节等多种药理活性［9］。乌骨藤中甾体苷包括通光藤苷 A、B、C、D、E、J、K 及通光藤新苷 A、B、C 等［9］，现代药理研究发现，乌骨藤中C21甾体苷类具有诱导和促使微管(肿瘤细胞赖以分裂、扩散的载体)蛋白质聚合、微管装备与微管稳定的独特作用机制。

表4 乌骨藤总苷对小鼠移植P388的抑制作用(，n=10)

表4 乌骨藤总苷对小鼠移植P388的抑制作用(，n=10)

注:与对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001;与环磷酰胺组比较，##P＜0.01

组别 剂量(mg·kg－1) 生存时间(d) 生命延长率(%)对照组10.9 ±2.15540 15.8 ±3.12＊＊ 40.25##乌骨藤总苷组76.11270 14.8 ±2.61＊＊ 35.28##135 13.5 ±3.25* 28.78##环磷酰胺 50 18.8 ±2.86＊＊＊

临床用消癌平片剂用法为每天3次，每次服8～10片，服用剂量太大，病人吞咽不方便，原因是现有乌骨藤口服制剂是以总提物入药，工艺简单、出膏率大、有效成分含量低导致，因而本研究拟对乌骨藤有效部位甾体总苷抗癌活性进行研究。消癌平制剂临床用于治疗食道癌、胃癌、肝癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、肠癌、宫颈癌、卵巢癌等多种实体癌及白血病等疗效显著，基于乌骨藤制剂临床所针对的肿瘤种类，本文选择了人胃癌细胞SGC－7901、小鼠移植S180、小鼠移植P388进行体内肿瘤抑制试验。

乌骨藤总苷的体外和体内试验表明，乌骨藤总苷对SGC－7901胃癌细胞株有直接生长抑制作用，其体内肿瘤抑制率呈剂量依赖关系，乌骨藤总苷高浓度组对SGC－7901体内抑瘤率达到98%，作用与5－氟胞嘧啶相当。乌骨藤总苷对小鼠移植肉瘤S180的体内试验表明，虽然乌骨藤总苷抑瘤率与空白组有显著差异，但乌骨藤总苷高中低3组的抑瘤率均弱于阳性药环磷酰胺。小鼠移植淋巴白血病细胞P388的抑制试验结果与肉瘤S180的体内试验类似，乌骨藤总苷抑瘤率与空白组有显著差异，但乌骨藤总苷高中低3组对淋巴白血病细胞P388的体内抑瘤率均弱于阳性药环磷酰胺。实验结果也与目前临床上消癌平制剂治疗胃癌相对具有较好疗效的结果一致。

本文研究结果表明乌骨藤总苷对人胃癌细胞SGC－7901、小鼠移植S180、小鼠移植 P388均较显著的体内抑制作用，有望开发成为剂量小、携带服用方便的新一代乌骨藤有效部位抗癌新药。

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