酶联免疫法与中和实验法检测破伤风抗体效价

李荣贞，赵 军，李庆英，苏文萍，官 静，赵玉美，苏甜甜

(1.山东省生物制品研究所，山东 泰安 271000;2.山东泰邦生物制品有限公司，山东 泰安 271000)

在破伤风人免疫球蛋白的生产中，对半成品及成品的破伤风抗体效价检测，通常采用中和实验法(SNT)［1］。该法耗时长、技术要求高、影响因素多、重复性差。据报道［2～5］，用酶联免疫法(ELISA)测定破伤风抗体效价，迅速、灵敏度高、重复性好、与SNT法测定的结果密切相关［6］，且操作简单。本文旨在对比SNT法与ELISA法测定破伤风抗体效价的结果，通过对结果的统计分析［7］，证明ELISA法测定破伤风抗体效价的可行性。

1 材料

标准破伤风毒素(中国生物制品检定研究院，批号:15#，1L+2 mg·mL－1);人源破伤风免疫球蛋白效价国家标准品(中国生物制品检定研究院，批号:001，10 IU/支);破伤风抗体酶联免疫诊断试剂盒(泰安京泰生物技术有限公司，共10批);供试品:破伤风人免疫球蛋白(山东泰邦生物制品有限公司共10批);17～19 g SPF级昆明小鼠(质控中心动物室);352型多功能酶标仪［热电(上海)仪器有限公司］。

2 方法

2.1 SNT法

2.1.1 破伤风抗毒素标准品的稀释 先预稀释至4.0 IU·mL－1，贮存于2～8℃备用，临用时用硼酸盐缓冲盐水稀释至0.5 IU·mL－1。

2.1.2 供试品溶液的制备 将供试品稀释成5个稀释度，各稀释度之间间隔约为5%，每mL含抗毒素约0.5 IU。

2.1.3 操作 准确吸取1 mL工作标准抗毒素及不同稀释度的供试品溶液，分别加入棕色小试管中，每管加入等量的实验毒素［5个试验量(L+/10)·mL－1］，混合均匀，加塞，37℃结合1 h。准确注射0.4 mL于小鼠腹部(昆明小鼠，SPF级，17～19 g)，标准品及供试品的每个稀释度各注射3只，连续观察5 d，供试品效价为与对照小鼠同时死亡或出现破伤风神经毒症状最重的最高稀释度判定。

2.2 ELISA法［8，9］以试剂盒中的样品稀释液分别稀释试剂盒携带标准品、供试品与国家标准品，并用破伤风人免疫球蛋白(批号:T201201，125 IU·mL－1)做质控样品。

样品稀释倍数的确定:样品的SNT法所测定的破伤风抗体效价均在120 IU·mL－1以上，试剂盒的线性范围在0.125～1 IU·mL－1之间，所以将质控品和供试品稀释至试剂盒的线性范围之内，最终确定样品稀释从1∶120到1∶480之间线性最好。

样品ELISA法效价的测定和计算:将国家标准品(10 IU/支)稀释至 1.0、0.5、0.25、0.125 IU·mL－1作为标准系列，供试品稀释至1∶120到1∶480之间。系列稀释的样品分别加到酶标板孔中，每个稀释度做2个孔。按试剂盒说明书操作完成实验。以国家标准品的浓度及对应的A450值做双对数曲线，(R2≥0.98试验成立)，建立线性回归方程，将不同稀释倍数的供试品稀释液A450值的对数值带入回归方程，并根据稀释倍数计算出供试品破伤风抗体效价。

3 结果

3.1 分别利用SNT法和ELISA法对10批供试品的破伤风抗体效价进行检测，再用ELISA法对这10批供试品进行检测时，均带质控样品(批号:T201201，破伤风抗体效价:SNT法测得的破伤风抗体效价为125 IU·mL－1)，所测数据如表1所示，对表1数据在Excel中进行分析，可知，ELISA法测得的质控品破伤风抗体效价算术平均数(¯x)为128 IU·mL－1，标准偏差(SD)为3，相对标准偏差(RSD)为3%。SNT法所测10批供试品破伤风抗体效价算术平均数(¯x)为126 IU·mL－1，标准偏差(SD)为 5，相对标准偏差(RSD)为4%，ELISA法所测10批供试品破伤风抗体效价算术平均数(¯x)为130 IU·mL－1，标准偏差(SD)为5，相对标准偏差(RSD)为4%，两种方法检测结果的RSD值均小于10%，结果均准确可靠。对表1中数据在Excel中利用统计函数CORREL分析得知:SNT法和ELSIA法检测10批破伤风人免疫球蛋白样品的破伤风抗体效价值，相关系数为0.91，说明两种方法相关性非常高。

3.2 利用不同批号的ELISA试剂盒分别对同一批号的国家标准品(GB)，质控品及供试品进行检测，检测结果如表2所示，对表2数据在Excel中进行分析，得知不同批号的ELISA试剂盒测得的国家标准品(批号:001)的破伤风抗体效价回收率均在96%～102%之间，结果稳定可靠。不同批号的ELISA试剂盒测得的质控品(批号:T201201)的破伤风抗体效价算数平均数(¯x)为127 IU·mL－1，标准偏差(SD)为2，相对标准偏差(RSD)为2%;不同批号的ELISA试剂盒测得的同一批供试品(批号:T201303)的破伤风抗体效价算术平均数(¯x)为124 IV·mL－1，标准偏差(SD)为 4，相对标准偏差(RSD)为4%。由上述数据可知，检测结果的RSD值均小于10%，检测结果均准确可靠。说明该实验所用的ELISA试剂盒稳定性和重复性较好，质量可靠，可用于成品及半成品的检测。

表1 破伤风人免疫球蛋白破伤风抗体效价SNT法与ELISA法检测结果比对

表2 不同批号的破伤风抗体酶联免疫诊断试剂盒所测破伤风抗体效价检测结果

4 讨论

表2数据显示，用试剂盒标准品测得的国家标准品回收率均在96%～102%之间，说明国家标准品与试剂盒所带标准品结果无显著性差异，初步说明试剂盒质量符合规定要求。表1数据显示SNT法与ELISA法所测结果，无明显差别，且两种方法检测结果的RSD值均小于10%，两种方法检测结果均准确可靠。但是，SNT法测抗体效价需要有完善的动物实验室、大量的小白鼠，而且检测结果影响因素多，周期长达5 d，操作繁琐［10］，而ELISA 法迅速、灵敏度高、重复性好、与SNT法测定的结果密切相关，操作简单。说明ELISA法可用于破伤风人免疫球蛋白中间过程的效价监控及作为SNT法的辅助方法。

ELISA法应注意的问题是:①选择质量稳定的试剂盒并严格按照说明书规范操作;②每次更换新批号的试剂盒前应用国家标准品(回收率95%～105%)考核试剂盒的质量;③每次试验都至少做2个平行，每次实验都带质控;④若试剂盒中洗涤液内有盐析现象，将洗涤液充分振荡溶解，混匀后再做稀释;⑤加样应准确，且在反应孔内混匀，因为抗原包被的是反应孔的表面;⑥在洗涤过程中，拍板的幅度要小，最好甩干，因为抗原与抗体的结合并不牢固，振动幅度太大，会使抗原抗体结合链断裂，引起花板现象。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(三部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录Ⅺ F.

［2］Layton GT.A micro－enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)and radioimmunosorbent technique(RIST)for the detection of immunity to clinical tetanus［J］.Med Lab Scien，1980，37(4):323 －329.

［3］Melville － Smith ME，Seagroatt VA，Watkins JT.A comparison of enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)with the toxin neutralization test in mice as a method for the estimation of tetanus antitoxin in human sera［J］.J Biol Stand，1983，11(2):137 －144.

［4］Cox JC，Premier RR，Finger W，et al.A comparison of enzyme immunoassay and bioassay for the quantitative determination of antibodies to tetanus toxin［J］.J Biol Stand，1983，11(2):123 －128.

［5］Gentili G，Pini C，Collotti C.The determination of the potency of human tetanus immunoglobulins by an enzymelinked immunosorbent assay［J］.J Biol Stand，1984，12(2):167－173.

［6］刘彩云，王淑芳，张振龙，等.应用ELISA与中和试验测破伤风抗毒素的比较［J］.中国生物制品学杂志，1995，8(4):175 －178.

［7］丁玉江，江昭伟，庞日强，等.一种检测人破伤风免疫血浆特异性抗体的快速准确方法［J］.中国输血杂志，2005，18(6):475 －477.

［8］余健，吴笛，周志军，等.一种辅助SNT测定人特异性免疫球蛋白抗体效价的ELISA方法的建立［J］.微生物学免疫学进展，2007，35(3):31 －34.

［9］朱华松，周志军，尹斌，等.人破伤风类毒素免疫血浆筛选试验中两种抗体检测方法的比较［J］.微生物学免疫学进展，2006，34(1):39 －42.

［10］李裕惠，郭中平，刘红.ELISA定量检测人狂犬病疫苗免疫血浆抗体的工作参比品制备［J］.中国输血杂志，2003，16(5):329－330.