高效液相色谱法测定荞麦中芦丁含量

穆志新 ，田 翔 ，周建萍 ，师 颖

（1.山西省农业科学院农作物品种资源研究所，农业部黄土高原作物基因与种质创制重点实验室，杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西太原030031；2.山西省农业科学院农产品质量安全与检测研究所，山西太原030031）

荞麦最早起源于我国，栽培历史悠久，种植经验也很丰富。荞麦味道清香，在日本、朝鲜、韩国以及我国的东北、华北等地区都是很受欢迎的食品[1-2]。荞麦是一种独特的药食两用作物，其营养价值和药用价值丰富。利用荞米和荞麦面粉直接加工可以制作成面条、烙饼、凉粉、灌肠等地方特色小吃。荞麦性甘味凉，含有非常丰富的天然生物活性成分黄酮类物质——芦丁。芦丁又称维生素P，属于维生素类药，能够有效地降低毛细血管的通透性和脆性，从而保持和恢复毛细血管的正常弹性；还可用于防治高血压、脑溢血、糖尿病、视网膜出血和出血性紫癜等，也可用作食品抗氧化剂和色素。此外，芦丁还是心脑血管用药合成曲克芦丁的主要原料，而曲克芦丁能有效地抑制血小板的聚集，防止血栓的形成。

荞麦中芦丁含量的高低影响着荞麦的品质。因此，本试验研究一种检测荞麦中芦丁含量的有效方法[3-4]，旨在为进一步选育高芦丁含量的荞麦品种以及将其用于医药工业奠定基础。

1 材料和方法

1.1 样品

供试苦荞样品由山西省农业科学院农作物品种资源研究所荞麦课题组育种专家提供。

1.2 仪器与试剂

Agilent1200高效液相色谱仪，美国安捷伦科技；AS10200AT超声波清洗器，天津奥特赛恩斯；BSA2202S分析天平，德国赛多利斯；Eppendorf5804R高速离心机，德国艾本德股份公司；DirectQ-3超纯水机，美国Millipole；DHG-9140AS电热鼓风干燥箱，宁波东南仪器有限公司。

甲醇色谱纯：Fisher Scientific；标准品芦丁（纯度98%）：Sigma；磷酸二氢钾优级纯：国药集团；水为超纯水。

1.3 色谱条件

安捷伦 C18柱（4.6mm×150 mm，5μm），柱温为30℃，甲醇∶0.5%磷酸（V/V）＝40∶60作为流动相，流速为1mL/min，进样量是5μL，检测波长为204 nm。

1.4 标准工作曲线

精密称取干燥的芦丁标准品10mg，加入甲醇定容至10mL，制成质量浓度为1mg/mL的储备液[5]。再将标准品稀释成 50，100，200，300，400μg/mL的质量浓度梯度。图1为芦丁标准品的高效液相色谱图，保留时间为3.475min[6-8]。

1.5 样品处理

取样10 g，置于40℃烘干箱中鼓风干燥4 h，立即放入旋风磨中粉碎，并全部通过0.177mm筛，备用。取制备好的试样0.10 g于2mL离心管中，加1mL甲醇振荡混匀，水温60℃超声萃取1 h，再以4 000 r/min的速度离心10 min，收集上清液，重复2次，并将2次提取液合并到25mL容量瓶中，用0.1mol/L磷酸调pH值至6左右，定容。过0.22μm有机滤膜备用[9-10]。

2 结果与分析

2.1 校准曲线的绘制与样品测定[11-13]

取1.4配制的系列标准混合工作溶液，质量浓度按从低到高顺序分别进样5μL，以标准工作溶液质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制校准曲线。同时取萃取好的待测样液过滤后进样5μL，记录峰面积。从工作曲线上查出待测各组分的质量浓度，根据稀释倍数，计算被测样品中各组分的百分含量。结果表明，芦丁标准品含量在50.0～400.0μg/mL范围内呈线性关系（图2），按照标准品质量浓度（x）与对应的色谱峰面积（y）得到线性方程：y＝10.946x－247.2（R2＝0.999 7）。

2.2 样品含量测定

按照1.5的方法处理荞麦样品，并且按照1.3的色谱条件进行分析，记录峰面积。根据浓度、稀释倍数以及样品的重复，计算得出荞麦中的芦丁含量。可以根据苦荞芦丁含量筛选出芦丁高含量苦荞种质资源[14]（表1）。图3为荞麦样品芦丁含量色谱图。

表1 24份核心种质资源芦丁含量

2.3 方法的精密度和回收率测定

称取0.1 g的芦丁质量分数为20.5mg/kg的荞麦样品6份，分别按照3个质量分数水平50，80，100mg/kg加入标准溶液，按本试验方法进行提取和测定（每个添加水平平行测定6次），计算平均加标回收率和相对标准偏差[15]。从表2可以看出，平均加标回收率介于97.2%～104.1%之间，相对标准偏差介于1.8%～2.3%之间，说明该方法准确、稳定、可靠。

表2 精密度和回收率测定结果

2.4 稳定性试验

12 h内每隔2 h对荞麦进样一次，记录峰面积，结果显示，供试样品峰面积的相对标准偏差为2.1%，表明样品的稳定性较好。

3 讨论

之前的研究往往采用60%～70%的乙醇或甲醇提取荞麦中的芦丁。在本试验中，采用流动相甲醇来提取荞麦中的芦丁，相比于用乙醇提取芦丁，该方法提取样品的稳定性以及试验的重复性都更好。在用高效液相色谱法检测芦丁的含量时，主要是通过控制流动相比例及检测波长来优化试验条件[16]。近年来，随着生活水平的不断提高，人们越来越注重食品的功能性，即食品的保健作用，作物育种工作的热点也随之向功能育种转变。种质资源是育种工作的物质基础，同样功能育种也需要发掘特异性状优良的种质。对所搜集的核心种质进行芦丁含量测定，筛选出芦丁高含量和高产量的荞麦种质，以期为荞麦功能育种提供依据。

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