响应面法优化金柑多糖碱提取工艺的研究

曾红亮　张怡　薛雅茹　刘骏　郑宝东

摘 要 为研究碱溶液提取金柑多糖的最佳工艺，考察液料比、提取时间、提取温度、NaOH浓度和提取次数等5个因素对金柑多糖得率的影响。在单因素研究的基础上，采用五元二次旋转正交设计对其工艺进行优化，利用SAS 9.2响应面分析程序得到回归方程。结果表明：回归方程达到显著水平，多糖的最佳碱提取工艺条件为：液料比（V/W）41 ∶ 1，提取时间3.5 h，提取温度89 ℃，NaOH浓度0.05 mol/L，提取次数3次。在此条件下，多糖得率为（8.56±0.23）%，与理论预测值基本一致，相比传统热水浸提法，多糖得率提高3.73倍。

关键词 金柑；多糖；碱提；响应面

中图分类号 R284.1 文献标识码 A

Optimization of the Alkali Extraction Technology of

Fortunella margarita Polysaccharides via

Response Surface Methodology

ZENG Hongliang， ZHANG Yi， XUE Yaru， LIU Jun， ZHENG Baodong*

College of Food Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract In order to study the optimum technology conditions of Fortunella margarita polysaccharides extracted by NaOH solution， the effect of liquid/material ratio， extraction time， extraction temperature， NaOH concentration and extraction times on the yield of F. margarita polysaccharides was investigated， respectively. On the basis of the single factor experiments， the conditions were optimized by the quadratic orthogonal rotation design with five factors. A regression equation was established by response surface methodology in SAS 9.2. The results showed that the equation reached significant level and the optimum conditions were as follows： liquid/material ratio of 41 ∶ 1（mL ∶ g）， extraction time of 3.5 h， extraction temperature of 89 ℃， NaOH concentration of 0.05 mol/L and 3-attempts extraction. Under the conditions， the yield of polysaccharides could be up to（8.56±0.23）%， which was consistent with the theoretical prediction value and increased by 3.73 times compared with the traditional hot water extraction method.

Key words Fortunella margarita； Polysaccharides； Alkali extraction； Response surface methodology

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.030

金柑（Fortunella margarita）又名金橘、夏橘，属芸香科常绿小乔木或灌木，柑橘族，金柑属植物，原产于中国，主要栽培在浙江、广西、江西、湖南、福建、广东等省（区）[1-2]。金柑营养价值很高，含有人体所需多种维生素、氨基酸以及丰富的多糖、精油、柠檬苦素、黄酮等活性物质[3-6]。金柑对防止血管破裂，减少毛细血管脆性和通透性，减缓血管硬化有良好的作用；对血压能产生双向调节作用，高血压、血管硬化及冠心病患者食之非常有益；金柑还可增强机体的抗寒能力，防治感冒[7-10]。目前，对于金柑的研究主要针对其民间药膳、相关食品的研发和采后保鲜等方面，对其活性成分的研究还处于初步阶段[11]。

多糖是金柑中的主要活性成分之一，目前，关于金柑多糖的提取及活性分析已有报道[12-14]，结果表明，金柑多糖对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和假单胞杆菌均有一定的抑制作用，且具有一定的清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的能力。热水浸提法是提取多糖的传统方法，但存在多糖得率低的问题，不利于后续对其进行结构和功能的研究[15-17]。碱液浸提法能破坏细胞壁，从而使细胞中可溶性成分溶出，可显著提高多糖的得率[18]。因此，本文以NaOH溶液为浸提剂，利用碱提醇沉法提取金柑多糖，考察液料比、提取时间、提取温度、NaOH浓度和提取次数等5个单因素对金柑多糖得率影响的基础上，采用响应面法对金柑多糖的最佳碱提工艺条件进行优化，为金柑多糖分离纯化、结构表征、功能学研究以及其综合开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 尤溪金柑（九成熟）由尤溪县农业局提供；乙醇、石油醚等均为国产分析纯试剂；本试验用水均为双蒸水。

1.1.2 仪器与设备 RE-52A型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；BCD-213KC型新飞冰箱：河南新飞电器有限公司；FZ102植物粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；AL104型精密分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；丹瑞HH-6型数显恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有双捷实验仪器厂；L530型台式低速离心机：长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；Unic-UV-2000型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；卤素快速水分测定仪：深圳市冠亚电子科技有限公司；LG-1.0型真空冷冻干燥机：新阳速冻设备制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金柑样品的前处理 新鲜金柑→筛选→清洗→去核→切片→80 ℃干燥24 h→粉碎→过40目筛→金柑粉末（水分含量<3%）。

金柑样品：取适量的金柑粉末，置于圆底烧瓶中，以1 ∶ 20比例加入石油醚，60 ℃回流浸提0.5 h，以脱去表面脂肪，纱布过滤；滤渣同样以1 ∶ 20比例加入95%的乙醇，70 ℃回流1 h，以脱去大部分色素，风干待用，即得到实验样品。

1.2.2 金柑多糖的提取工艺流程 金柑样品→碱液浸提→离心→上清液→减压浓缩→醇析→离心→沉淀→冻干→测定。

1.2.3 多糖得率的测定

多糖得率=×100%

1.2.4 单因素试验 取10 g金柑粉末样品，以金柑多糖得率为指标，研究液料比（文中均为V/W）、提取时间、提取温度、NaOH浓度和提取次数对多糖得率的影响。分别选取液料比为20 ∶ 1、25 ∶ 1、30 ∶ 1、35 ∶ 1、40 ∶ 1、45 ∶ 1、50 ∶ 1，提取时间1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h，提取温度为50、60、70、80、90、100、110 ℃，NaOH浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mol/L和提取次数为1、2、3、4、5次进行单因素试验（平行试验3次）。

1.2.5 响应面优化试验 根据单因素试验结果，采用五元二次回归分析法研究金柑碱提过程中液料比、提取时间、提取温度、NaOH浓度和提取次数与多糖得率的关系，并根据SAS 9.2软件处理数据得二次回归方程，采用响应面分析法得到最佳工艺条件。

1.2.6 验证试验 根据响应面预测的最佳提取工艺参数，按照“1.2.3”的方法操作，测定实际得到的金柑多糖得率，以验证响应面预测的准确性。

1.3 数据处理

采用SAS 9.2对试验数据进行处理，并对模型进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 正交试验设计与结果

由单因素试验可知：液料比选择35 ∶ 1、提取时间选择2.5 h、提取温度选择80 ℃、NaOH浓度选择0.04 mol/L和提取次数选择3次为最佳条件。根据单因素试验结果，以液料比（X1）、提取时间（X2）、提取温度（X3）、NaOH浓度（X4）和提取次数（X5）为变量，以多糖得率（Y）为目标函数，设计五元二次通用旋转正交试验，各试验因素和水平见表1。

按五因子1/2实施安排试验， 变量参数P=5，星号臂值R=2，其中，试验的次数Mc=2P-1=16， 星号点试验次数Mr=2P=10， 中心点试验次数M0=10，因此，总试验点N=Mc+Mr+M0=16+10+10=36，即36个处理组合[19-20]。试验设计及结果见表2。

2.2 模型的建立及显著性分析

采用SAS 9.2中的RSREG程序对表2的数据进行回归分析，各因素经回归拟合后，得到多糖得率的五元二次方程如下：

Y=-43.666 2+0.355 1X1+1.210 4X2+0.708 7X3+320.854 2X4+2.056 0X5-0.006 2X1X1+0.062 2X2X1-0.524 6X2X2+0.001 3X3X1-0.001 9X3X2-0.004 1X3X3-3.187 5X4X1+13.875 0X4X2+0.131 3X4X3-3 023.958 3X4X4-0.008 4X5X1-0.171 3X5X2-0.012 7X5X3+14.187 5X5X4-0.101 1X5X5

该模型的方差分析结果见表3。

从表3可看出，回归模型的P值小于0.000 1，表明该回归模型极显著；模型相关系数R2=0.972 1，变异系数CV=3.811 6，且失拟项不显著，说明响应值的变化有97.21%来源于所选变量，模型可以较好的解释试验所得多糖得率的变化。因此，该回归方程可以较好的描述各因素与金柑多糖得率之间的真实关系，可用于确定最佳提取工艺条件。一次项、二次项的P值均小于0.000 1，说明一次项和二次项对多糖得率的影响极显著，而交互项的P值大于0.05，所以交互项对多糖得率的影响不显著。

各回归系数方差分析结果见表4。由表4可知，各因素对多糖得率的影响程度从大到小依次排列为：提取温度、NaOH浓度、提取次数、液料比和提取时间。在一次项中，X3和X4对金柑多糖得率的影响达到极显著水平，X5对金柑多糖得率的影响达到显著水平，而X1和X2对其影响不显著；在二次项中，X1、X3和X4对金柑多糖得率的影响达到极显著水平，X2和X5对其影响达到显著水平；在交互项中，提取时间和液料比的交互作用（X2X1）、NaOH浓度和液料比的交互作用（X4X1）以及提取次数和NaOH浓度的交互作用（X5X4）对金柑多糖得率的影响达到显著水平，其余交互项对其影响不显著。

2.3 响应面图和等高线图分析

由回归模型方差分析结果（表4）可知，各因素对多糖得率的影响程度大小依次为：X3>X4>X5>X1>X2。X1、X2、X3、X4和X5二次项的系数均为负值，方程表示的抛物面开口向下有极大值点[21]。响应面图是响应值对各试验因子构成的三维空间的曲面图。等高线图为二维图，它将具有相同的响应值的所有点连接在一起，形成恒定响应的等值线[22]。提取时间和液料比（X2X1）的交互作用、NaOH浓度和液料比（X4X1）的交互作用以及提取次数和NaOH浓度（X5X4）的交互作用对金柑多糖得率的影响显著，交互作用的响应面图和等高线图见图1～3。

由图1可知，提取时间不变时，多糖得率随液料比的增大而增加，但并非持续增加，当液料比达37 ∶ 1～45 ∶ 1时多糖得率达到最大值，再继续增大液料比，多糖得率反而开始下降，这是由于加水量过大稀释了多糖，在一定体积倍数醇沉淀的过程中不利于多糖沉淀出来。由图2～3可知，液料比和提取次数固定不变时，多糖得率随NaOH浓度的增大而增加，但并非持续增加，当NaOH浓度达0.04～0.058 mol/L时多糖得率达到最大值，再继续增大NaOH浓度，多糖得率反而开始下降，这可能是由于碱浓度过高会使多糖发生脱酯和β-消去反应，使多糖结构受到破坏，多糖得率下降[18]。从图1～3可知，各图形的曲面较陡，直观反映了各因素的交互作用对多糖得率的影响较显著，这与方差分析的结果一致。

2.4 金柑多糖碱提工艺的确定

结合回归模型，由SAS 9.2软件分析得到金柑多糖最佳的碱提工艺条件为：液料比40.875 4 ∶ 1，提取时间3.519 5 h，提取温度88.641 9 ℃，NaOH浓度0.049 5 mol/L和提取次数3.403 5次，多糖得率为8.5683%。根据实际情况调整的最佳提取条件为：液料比41 ∶ 1，提取时间3.5 h，提取温度89 ℃，NaOH浓度0.05 mol/L和提取次数3次。在此条件下重复3次试验，金柑多糖得率分别为8.79%、8.34%、8.55%，平均值为（8.56±0.23）%，与理论预测值基本一致，说明回归模型可靠。

2.5 与传统热水浸提法的对比

笔者之前的研究结果表明[12]，金柑多糖水提的最佳工艺条件为：液料比38 ∶ 1、温度88 ℃、提取时间2.5 h、乙醇含量70%和提取3次，在此条件下，多糖得率为1.81%。在本研究所得最佳的碱提工艺条件下，多糖得率为8.56%，即比传统热水浸提法提高3.73倍。说明该方法操作简单，多糖得率高，可有效地应用于金柑多糖的提取。

3 讨论与结论

在提取多糖的相关研究中，认为碱提法有利于多糖的溶出，尤其是粘多糖[23]。金柑多糖较粘稠，适合采用碱提法提取。就多糖得率而言，碱提法要明显优于传统的热水浸提法，但碱液可能对多糖的分子结构和理化性质产生影响，而这两方面都与多糖的生物学特性有着密切的联系[24]。Ai等[25]的研究结果表明，碱提法和水提法得到的胖大海籽多糖的单糖组成和比例均一致，碱提法未对胖大海籽多糖的结构造成影响；而Yi等[26]的研究结果表明，碱液使龙眼肉多糖的链构象发生了改变，且提高了龙眼肉多糖的免疫活性。碱液是否会影响多糖的分子结构和理化性质受到很多因素的影响，如碱浓度，提取时间和多糖结构等。因此，碱提法是否会对金柑多糖的结构、理化性质和生物活性产生影响，需有待进一步研究。

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