南方根结线虫被穿刺巴斯德芽菌侵染后寿命和生殖相关基因的表达变化

鲁琰 邹潇潇 黄惠琴 刘敏 鲍时翔

摘  要  为了探讨南方根结线虫在植物体外被穿刺巴斯德芽菌感染后存活率的变化及感染初期线虫寿命和生殖相关基因的表达情况。首先利用单卵块孵化法对从野外采集的根结线虫进行纯化和分子鉴定。以穿刺巴斯德芽菌孢子体外吸附的南方根结线虫为材料，在显微镜下观察供试线虫的存活情况，每24 h计数一次死亡线虫的条数，总共观察12 d。在被穿刺巴斯德芽菌吸附的第3天收集根结线虫，提取线虫总RNA，采用实时荧光定量PCR检测线虫寿命相关基因cyp-33和生殖相关基因lin-45/mek-2的表达情况。结果表明：通过分子鉴定确认纯化的根结线虫为南方根结线虫;感染了穿刺巴斯德芽菌的南方根结线虫死亡率显著升高;同时在穿刺巴斯德芽菌吸附南方根结线虫的初期，线虫寿命相关基因cyp-33和生殖相关基因lin-45/mek-2的表达水平与对照组相比均下调（p<0.05）。这说明穿刺巴斯德芽菌在吸附南方根结线虫的初期能够促使线虫的存活率降低，并抑制其生殖能力，这可能与基因cyp-33、lin-45和mek-2的调控有关。

关键词  南方根结线虫;穿刺巴斯德芽菌;荧光定量PCR;存活率

中图分类号  R383.1          文献标识码  A

Expression Changes of Life-related and Reproduction-related

Genes of Meloidogyne Incognita Infected by Pasteuria Penetrans

LU Yan1，2，3， ZOU Xiaoxiao2， HUANG Huiqin2， LIU Min2， BAO Shixiang2*

1 College of Agriculture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China

3 Hainan Medical College， Haikou， Hainan 571199， China

Abstract In order to investigate the influence of Pasteuria penetrans on the survival rate of Meloidogyne incognita and the expression of life-related gene and reproduction-related gene at the beginning of adsorption，the authors purified M. incognita collected from wild and identified it with molecular biology methods firstly. Then M. incognita was adsorpted by P penetrans in vitro. Within twelve days the researchers observed M. incognita with microscope and counted the number of dead M. incognita every 24 hours. The total RNA of M. incognita was extracted at the third day after M. incognita was adsorpted. Real time quantitative PCR was used to detect the expression of cyp-33、lin-45 and mek-2 gene. The authors confirmed that the purified nematode was M. incognita and the death rate of M. incognita significantly increased when infected by P. penetrans. At the same time the expression of life-related gene cyp-33 and reproduction-related genes lin-45 and mek-2 reduced at the beginning of adsorption comparing with the control group（p<0.05）. P. penetrans could reduce the lifespan and reproduction of M. incognita. The mechanism may be related to the regulation of cyp-33、lin-45 and mek-2 gene.

Key words  Meloidogyne incognita; Pasteuria penetrans; Real time quantitative PCR; Survival rate

doi  10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.020

根结线虫（Meloidogyne spp.）是一类分布广泛的植物寄生线虫，对农作物的危害非常严重。每年由于根结线虫病导致的经济损失在全球范围内高达数百亿美元[1]。近年来，根结线虫病的危害在国内也愈演愈烈，其中分布最广、危害最大的是南方根结线虫[2-3]。穿刺巴斯德芽菌（Pasteuria penetrans）是根结线虫的专性寄生菌，也是最具潜力的根结线虫生防因子[4-5]。穿刺巴斯德芽菌的孢子能特异性吸附在根结线虫体表，然后进入线虫体内萌发，夺取线虫体内营养并在宿主体内生长发育[6]。而根结线虫由于穿刺巴斯德芽菌的侵入，生殖腺发育不完全，生殖系统遭到严重破坏，不能产卵或只能形成少量的卵，最终导致根结线虫严重不育，线虫的虫口密度由此降低[7]。

目前对于穿刺巴斯德芽菌与根结线虫互作的详细机制尚不清楚，南方根结线虫被穿刺巴斯德芽菌感染后线虫基因表达水平的研究也未见报道。鉴于此，本研究在实验室内用穿刺巴斯德芽菌吸附南方根结线虫，探讨线虫被穿刺巴斯德芽菌吸附后存活率的变化，并在吸附初期收集线虫总RNA，用荧光定量PCR技术检测线虫寿命相关基因cyp-33和生殖相关基因lin-45/mek-2的表达情况，为下一步研究穿刺巴斯德芽菌吸附南方根结线虫初期的转录组分析奠定基础，也为将来探索根结线虫的生物防治提供新思路。

1  材料与方法

1.1  材料

Taq DNA polymerase、Marker Trans 2K Plus等购自北京全式金生物技术有限公司;DNA Marker DM2000购自北京康为世纪生物科技有限公司;M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒、2×SG Fast qPCR Master Mix试剂盒、DEPC购自上海生工生物技术公司;RNeasy Plus Mini Kit 购自Qiagen公司。

1.2  方法

1.2.1  穿刺巴斯德芽菌的收集   采集已人工接种穿刺巴斯德芽菌和根结线虫的番茄病根，用清水洗去附着的土壤后挑取病根根结中的雌虫，置于1.5 mL离心管中，用1%的次氯酸钠消毒5 min后，用无菌水漂洗3次，再用无菌镊子压破雌虫，加入1 mL无菌水制成悬浮液，置于光学显微镜（400×）下观察有无穿刺巴斯德芽菌的特征性孢子[7-9]。收集孢子样品，用血球计数板计数孢子浓度，保存于4 ℃冰箱中待用[9]。

1.2.2  南方根结线虫的采集和纯化培养   从海南定安的胡椒园里采集带有根结的胡椒根，在解剖镜下用解剖针挑取单个卵块，用1%的次氯酸钠消毒后将卵块置于清水中孵化，2 d后将孵化出的2龄幼虫接种于预先培植于消毒土的番茄根部。接种50 d后拔出番茄苗，观察番茄根部是否有根结、根结数目及是否有卵块。当根结上出现卵块时，挑取成熟的根结线虫卵块，消毒后再次孵化转接到番茄根部，以此扩繁根结线虫[10]。

1.2.3  根结线虫分子鉴定   收集由卵块孵化出的2龄幼虫，提取线虫基因组DNA[11-12]。根结线虫分子鉴定方法参照Meng等[13]的方法，选取MI-F/R、MJ-F/R、MT-R/MI-F 3对引物做PCR。引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列见表1。PCR反应采用50 μL体系：10×EasyTaq Buffer 5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，EasyTaq DNA polymerase 1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 33 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环;72 ℃ 10 min。PCR扩增结束后，取PCR产物2 μL 用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带。

1.2.4  穿刺巴斯德芽菌体外吸附根结线虫   挑取40个根结线虫卵块放入1.5 mL离心管中，加入500 μL的无菌水吹打冲洗3次。加入1%的次氯酸钠消毒5 min后，再用无菌水吹打冲洗3次。卵块分装至96孔板中，放置于25 ℃恒温培养箱孵化。卵块孵化48 h后，取孵化出的2龄幼虫置于96孔板中，每孔60条左右，实验组每孔加10 μL（5.48×104个）穿刺孢子液，放置于25 ℃恒温培养箱。12 d内每隔24 h在显微镜下观察根结线虫并计数死亡和存活的线虫条数，实验重复3次[15-16]。根据统计结果计算各组线虫的死亡率。

线虫死亡率=■×100%

1.2.5  南方根结线虫总RNA的提取   在穿刺巴斯德芽菌吸附南方根结线虫的第3天收集2龄幼虫，同时收集未被穿刺巴斯德芽菌吸附的南方根结线虫作对照，14 000 r/min 4 ℃离心10 min。用线虫M9缓冲液（每升含15.12 g Na2HPO4·12H2O，3 g KH2PO4，5 g NaCl，0.25 g MgSO4·7H2O，0.12 g MgSO4）洗线虫1次，14 000 r/min 4 ℃离心10 min，弃去上清。将虫体转移到无RNA酶的离心管中。按照试剂盒说明书，用Qiagen的RNeasy Plus Mini Kit提取线虫总RNA。总RNA样品放置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.6  线虫相关基因的实时荧光定量PCR检测   将根结线虫的总RNA用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒，反转录得到线虫的cDNA。Real time PCR采用SYBR GreenⅠ染料法，使用2×SG Fast qPCR Master Mix试剂盒，在美国安捷伦Mx3005P实时荧光定量PCR仪上扩增目的基因。反应体系（20 μL）：2×SG Fast qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板2 μL，DNF buffer 2 μL，PCR-grade water 5 μL。实时荧光定量PCR反应参数：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性15 s，60 ℃退火50 s，共40个循环。每个样品设3个重复。采用2△△CT法对PCR结果进行定量分析。

1.3  数据分析

实验数据经Microsoft Excel 2003处理后，采用SPSS Statistics 17.0统计软件进行差异显著性分析，组间比较采用t检验进行分析。

2  结果与分析

2.1  根结线虫鉴定结果

提取根结线虫2龄幼虫的基因组后，用3对引物（MI-F/R、MJ-F/R、MT-R/MI-F）对根结线虫进行分子鉴定。结果发现，引物MI-F/R、MT-R/MI-F分别扩出1 000、780 bp的条带，而引物MJ-F/R未扩增出条带（图1），据此可确定纯化的根结线虫为单一的南方根结线虫[13]。

2.2  穿刺巴斯德芽菌对南方根结线虫存活率的影响

实验结果表明，在清水中南方根结线虫的死亡率随时间的延长呈递增趋势，在吸附的第3天实验组的南方根结线虫死亡率达31.8%，对照组根结线虫的死亡率为14.6%;到第4天实验组线虫的死亡率是40%，对照组线虫死亡率仍然是14.6%;到吸附的第12天实验组线虫的死亡率是93.9%，对照组线虫死亡率为53.2%。虽然2组线虫的死亡率随时间的延长均呈递增趋势，但实验组根结线虫的死亡率一直高于对照组（图2）。此外，在穿刺巴斯德芽菌吸附南方根结线虫的过程中，南方根结线虫体表吸附的穿刺孢子个数在吸附初期与吸附时间呈正相关（图3）。

2.3  南方根结线虫总RNA的提取

提取的南方根结线虫总RNA用1%的琼脂糖凝胶， 在1×TAE电泳缓冲液中120 V电泳30 min，在紫外灯下检测RNA条带并拍照（图4）。再取1 μL总RNA 用Nanodrop2000分光光度计测定RNA的浓度和纯度（表2）。从图4中可看出，提取的RNA完整性良好，浓度和质量均达到了实验要求。

2.4  荧光定量PCR检测基因cyp-33、lin-45和mek-2的表达情况

荧光定量PCR的溶解曲线峰形窄而尖，无杂峰，扩增产物特异性良好。在荧光定量扩增曲线上，基因指数扩增期和平台期均十分明显，线性范围广，表现为理想的扩增曲线。荧光定量PCR结果的相对定量分析结果发现，感染了穿刺巴斯德芽菌后南方根结线虫的寿命相关基因cyp-33和生殖相关基因lin-45/mek-2表达下调（图5）。采用SPSS软件进行差异显著性分析，结果表明：P（cyp-33）=0.001、P（mek-2）=0.005均小于0.01，差异极显著;P（lin-45）=0.038小于0.05，差异显著。综上所述，被穿刺巴斯德芽菌感染初期的南方根结线虫与对照组相比，cyp-33、lin-45和mek-2基因的表达水平显著下调。

3  讨论与结论

穿刺巴斯德芽菌是目前公认的防治根结线虫最有效的生物防治剂[17]。它不具有运动能力，当根结线虫的2龄幼虫在土壤中运动时，触碰到穿刺巴斯德芽菌的孢子，穿刺孢子表面的一些特殊蛋白能特异粘附在根结线虫2龄幼虫的表面，在某种酶的作用下，孢子的芽管会突破芽孢底部的粘着层并穿透线虫表皮，伸入线虫体内[18]，夺取线虫体内营养，降低线虫的虫口密度。虫体死亡、裂解之后，成熟的孢子又重新释放到土壤中，开始新的侵染循环[17，19]。由于穿刺巴斯德芽菌防治根结线虫高效无污染，因此，目前该方面研究备受关注[20-21]。

本研究在植物体外用穿刺巴斯德芽菌吸附南方根结线虫，观察线虫存活率及吸附初期寿命和生殖相关基因表达水平的变化。结果发现，穿刺巴斯德芽菌吸附南方根结线虫后能降低线虫的存活率，寿命和生殖基因在吸附早期已经下调表达。线虫寿命相关基因cyp-33的上调能够延长线虫寿命[22]，而穿刺吸附南方线虫后线虫存活率降低，cyp-33基因表达下调。这说明穿刺巴斯德芽菌在感染南方根结线虫后能够降低线虫的存活率，这可能与cyp-33的表达下调有关，但具体机制仍不明确。线虫生殖相关基因lin-45/mek-2是Ras信号传导通路中的2个重要成员，它能够促进排泄管、阴门细胞的发育，在线虫的生长发育中扮演着重要角色[14，23]，而实验结果显示穿刺菌吸附南方根结线虫后线虫的lin-45/mek-2基因表达均下调。何元等[6]研究发现，穿刺巴斯德芽菌吸附根结线虫后的第7天，根结线虫的生殖腺长度只有对照线虫的90%左右，且随着吸附时间的延长，线虫的生殖器官发育更迟缓。这提示了被穿刺巴斯德芽菌吸附后根结线虫生殖系统发育受到抑制可能与Ras信号传导途径上的基因表达下调有关。但具体机制目前仍不明确，实验结果仍需进一步验证。

在本研究的基础上，笔者们将运用转录组测序技术分析南方根结线虫被穿刺巴斯德芽菌感染初期的转录组变化，从分子水平阐述二者的互作机制，为将来研究穿刺巴斯德芽菌与根结线虫的互作和根结线虫的防治提供新策略。

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