枇杷花药胚状体诱导条件的优化

陶炼　潘翠萍　谢红江　王永清　杨文渊　唐一平　涂美艳

摘 要 以‘大五星枇杷花药为外植体，研究小孢子发育时期、低温处理及植物生长调节剂对花药愈伤组织诱导及胚状体发生的影响。结果表明：枇杷小孢子发育时期与花蕾横径存在对应关系，横径为4.68～5.28 mm的枇杷花蕾处于单核靠边期，此时期的小孢子胚状体诱导率最高，为25.05%；经4 ℃低温处理2 d的花药愈伤组织诱导率最高，达69.93%；花药愈伤组织诱导的最适培养基是MS+2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L，愈伤组织诱导率为78.22%；枇杷花药愈伤组织诱导胚状体的最适培养基为MS+ZT 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+IBA 0.05 mg/L，胚状体诱导率为25.56%。

关键词 枇杷；花药培养；愈伤组织；胚状体

中图分类号 S667.3 文献标识码 A

Optimization of Inducing Conditions of Embryogenesis

in Loquat（Eriobotrya japonica Lindl.）

TAO Lian1 ， PAN Cuiping2， XIE Hongjiang1， WANG Yongqing2 *，

YANG Wenyuan1， TANG Yiping3， TU Meiyan1

1 Horticulture Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu，Sichuan 610066， China

2 College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Ya'an，Sichuan 625014， china

3 Agricultural and Forestry Bureau， Longmatan District， Luzhou， Sichuan 646000， China

Abstract The anthers of loquat（Eriobotrya japonica Lindl. cv.‘Dawuxing）were used as the material to optimize the plant regeneration system. A series of experiments were carried out to investigate the effects of microspore developmental stages， 4 ℃ low temperature pretreatment and growth regulators on the anther callus induction and somatic embryogenesis. The results showed that there was corresponding relationship between transverse diameter of flower bud and the developmental stages of microspore. When the transverse diameter of flower buds was 4.68-5.28 mm，the microspore was at the late-uninucleate developmental stage which was suitable for inducing embryoids with a rate of 25.05%. Two days of 4 ℃ cold treatment in darkness to anthers were more favorable， resulting in 69.93% of callus formation. The most suitable medium for anther callus induction was MS（Murashige and Skoog）medium supplemented with 2，4-dichlorophenox acetic acid（2，4-D） 5mg/L and 6-benzyladenine（6-BA）2.0 mg/L， in which anther calluses were induced at a frequency of 78.22%. The most suitable medium for anther-derived embryos induction was MS supplemented with zeatin（ZT）0.05 mg/L， a-naphthalene acetic acid（NAA）0.01 mg/L and indolebutyric acid（IBA）0.05 mg/L， in which embryos were induced at a rate of 25.56%.

Key words Loquat； Anther culture； Callus； Embryoid

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.019

枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.]属于蔷薇科（Rosaceae）枇杷属（Eriobotrya），原产我国西南（川雅安市境内大渡河流域），枇杷秋萌冬花，春实夏熟，在百果中独具先天四时之气，被誉为独冠时新的嘉果珍味，深受人们喜爱[1]。

大量研究结果表明，胚状体是理想的遗传转化受体材料[2]。其中，花药胚状体不仅有利于遗传转化体系的建立，同时还能得到单倍体，经人工加倍后可快速获得纯合二倍体，从而缩短育种年限，提高育种效率， 在一些作物上已有较大成果[3-4]。自1964年，Guha等[5]首次通过花药培养的方法诱导出了世界上第一例曼陀罗花药胚状体，并最终获得再生植株后，花药培养技术得到迅猛发展，据不完全统计，目前已有23科52属约300种高等植物的花药培养获得成功[6]。有关枇杷花药胚状体方面的报道较少，李俊强等[7]初步建立了枇杷花药培养及植株再生技术体系，但存在胚状体诱导率低的问题，限制了该项技术的广泛应用。

本试验以‘大五星枇杷花药为材料，在前人工作基础上对影响枇杷花药胚发生的条件进行了优化，为建立高效且适宜枇杷遗传转化的花药胚状体再生系统奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

栽植于四川农业大学园艺生物技术研究中心枇杷园的12年生‘大五星枇杷花药。

1.2 方法

1.2.1 小孢子发育进程的观察 在减数分裂结束即发育到四分体之后，于晴天上午（9 ： 00～11 ： 00）和下午（15 ： 00～16 ： 00）每隔1 h左右取样，用卡诺Ⅰ固定液（无水乙醇 ∶ 冰乙酸=3 ∶ 1）固定24 h后转入70%酒精，4 ℃冰箱保存备用，并边固定边制片跟踪观察。改良品红染色和压片处理，奥林巴斯BX-51显微镜观察雄配子体发育各时期典型特征，DP70摄像头拍照、CCD软件进行照片处理，每个时期至少观察40个视野。改良品红压片观察雄配子体发育过程的同时，观察花蕾外部形态的变化。鉴于枇杷花蕾内小孢子母细胞发育过程分裂相不同步，分裂期以全部分裂相中占大多数的时期为准。

1.2.2 小孢子不同发育时期胚状体的诱导 分别取四分体时期、单核居中期、单核靠边期及双核期的小孢子经低温预处理48 h后接种于愈伤组织诱导培养基MS+2.4-D 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L上，然后将获得的愈伤组织（花药愈伤体积相当于花药大小时）转移到胚胎诱导培养基MS+ZT 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+IBA 0.05 mg/L上培养， 培养30 d后统计胚状体诱导率（发生胚状体的愈伤数/接种愈伤数×100%）。

1.2.3 花药愈伤组织诱导的低温处理 采集处于单核靠边期的枇杷花蕾，分别对其进行不同时间4 ℃低温处理，低温处理时间设置为24、48、72、96、120 h，以不处理为对照，处理后的花蕾经表面灭菌后接种于愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+蔗糖70 g/L+琼脂7.5 g/L上。每个处理接种450枚花药，重复3次。接种后定期观察并记录花药形态变化，花药愈伤启动生长情况，30 d后统计愈伤组织诱导率（长出愈伤的花药数/成活的花药数×100%）、愈伤组织质地及长势。

1.2.4 花药愈伤组织诱导 将经4 ℃低温处理后的枇杷花蕾去除表面绒毛，少量洗衣粉加两滴吐温20清洗，流水冲洗2 h。75%酒精消毒20 s，无菌水冲洗2次，再用0.1%升汞表面灭菌12 min，无菌水冲洗多次。剥开花蕾取出花药，并彻底去除与花药相连的花丝，花药愈伤组织的诱导以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA（1.0、2.0、3.0 mg/L）、2，4-D（0.1、0.25、0.50、0.75、1.0 mg/L），采用两因素完全组合试验设计，附加蔗糖70 g，琼脂7.5 g，pH5.8，每个材料接种15瓶，每瓶接种10～15枚花药，重复3次。接种后定期观察并记录花药形态变化，花药愈伤启动生长情况，培养30 d后统计愈伤组织诱导率（长出愈伤的花药数/成活的花药数×100%）、愈伤组织质地及长势。

1.2.5 胚状体的诱导 将初代培养获得的花药愈伤组织（花药愈伤体积相当于花药大小时）从花药壁上剥离下来，转至胚状体诱导培养基上，胚状体诱导培养基以MS为基本培养基，添加不同浓度的ZT（0. 05、0.1、0.5 mg/L）、NAA（0.01、0.03、0.05 mg/L）、IBA（0.05、0.1、0.15 mg/L），采用三因素三水平正交试验设计，同时附加蔗糖30 g，琼脂7.5 g，pH5.8，每处理接种150个外植体，重复3次，培养30 d后统计胚状体诱导率（发生胚状体的愈伤数/接种愈伤数×100%）。

1.2.6 培养条件 培养温度（25±1）℃，光照时间14 h/d，光照强度为1 500 lx。

1.3 数据分析

所得数据用DPS7.05软件进行统计分析，多重比较采用Duncan新复极差法。

2 结果与分析

2.1 枇杷小孢子发育进程的观察

减数分裂结束（四分体时期）（图1-A），‘大五星枇杷小孢子进入雄配子体发育阶段，由单核期（图1-B、C、D）、双核期（图1-E）至成熟花粉（图1-F）的雄配子体发育过程中，花蕾横径长度总体呈增加趋势（表1），变化幅度在4.42～6.04 mm之间，花药颜色则由嫩绿色转变为浅绿色，至成熟花粉时呈浅黄色。

2.2 小孢子发育时期对胚状体诱导的影响

表2显示，四分体时期及双核期的小孢子均不能诱导出胚状体，只有单核期的小孢子才能诱导出胚状体，其中单核居中期有少量小孢子能诱导出胚状体，诱导率为3.23%，单核靠边期胚状体诱导率最高，达25.05%，结合表1可知，单核靠边期的花蕾直径为4.68～5.28 mm。

2.3 不同低温处理对枇杷花药愈伤组织诱导的影响

表3显示，对枇杷花蕾进行24、48 h的4 ℃低温处理，与对照比较，愈伤组织发生时间在统计学上没有显著性差异，但愈伤组织诱导率不同，以低温处理48 h愈伤组织诱导率最高，达69.93%，极显著高于对照的3.31%，愈伤组织呈绿色致密颗粒状。随着低温处理时间的延长，愈伤组织诱导率逐渐降低，当处理时间达到96 h时，诱导率下降为5.54%，当处理时间为120 h时，没有愈伤组织的发生。因此，枇杷花药愈伤组织的诱导以4 ℃低温处理花蕾48 h为宜。

2.4 外源激素对花药愈伤组织诱导的影响

花药在诱导培养基上培养21 d，花药膨胀明显，边缘开始出现绿色或黄绿色颗粒状愈伤组织。对愈伤组织诱导率进行方差分析，F检验表明，2，4-D对枇杷花药愈伤组织的诱导有极显著的影响（F2，4-D=32.7，p<0.01），6-BA有显著的影响（F6-BA=5.18，0.01﹤p<0.05），当6-BA一定时，愈伤组织诱导率随2，4-D浓度的上升而上升；在2，4-D 0.5 mg/L、6-BA 2.0 mg/L时，愈伤组织诱导率最高，达到了78.22%，极显著高于其他处理，愈伤组织长势好，呈绿色致密颗粒状（图2-A），随着2，4-D浓度的继续增加（2，4-D﹥0.5 mg/L），愈伤诱导率反而降低，当2，4-D浓度为1.0 mg/L、6-BA浓度为3.0 mg/L时，诱导率最低，仅为14.25%，愈伤组织呈现黄绿色块状（图2-B）。综上所述，培养基MS+2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L为枇杷花药花愈伤组织诱导的适宜培养基（表4）。

2.5 外源激素对愈伤组织形成胚状体的影响

花药愈伤组织接近花药大小时，立即转入胚胎诱导培养基上，经过1～2周左右的培养，部分愈伤组织结构发生变化，形成质地脆嫩、结构致密的胚性愈伤组织。再经过4～5周培养后，胚性愈伤组织表面开始凸起，出现球胚（图3-A）。球形胚继续发育，经过心形胚（3-B），鱼雷形胚（图3-C），最后发育形成簇状的子叶胚（图3-D）。

表5显示，较低浓度的ZT、NAA和IBA组合有利于枇杷花药胚状体的诱导，当ZT选用0.05 mg/L、NAA选用0.01 mg/L、IBA选用0.05 mg/L时，胚状体诱导率最高，为25.56%，极显著高于其他处理，其次为ZT 0.05 mg/L、NAA 0.03 mg/L与IBA 0.1 mg/L的组合，诱导率为18.81%。较高浓度的ZT、NAA与IBA的组合对胚状体的诱导反而不利，当ZT选用0.5 mg/L、NAA选用0.01mg/L、IBA选用0.15 mg/L与 ZT选用0.5 mg/L、NAA选用0.05mg/L、IBA选用0.1 mg/L的浓度组合时，胚胎诱导率为0。对胚状体诱导率进行方差分析表明，ZT、NAA、IBA对胚状体的诱导均达到了极显著的水平（p﹤0.01），且ZT占主导作用（FZT=2 630.10），NAA的影响作用次之（FNAA=348.74），影响最小的是IBA（FIBA=215.39）。综上所述，适宜枇杷花药愈伤组织胚状体诱导的培养基为MS+ZT 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+IBA 0.05 mg/L。

3 讨论与结论

3.1 小孢子发育时期与花药培养效率

多数研究表明小孢子细胞发育时期一般经历四分体时期、单核居中期、单核靠边期、双核期和成熟花粉粒时期[8]。本实验研究了‘大五星枇杷小孢子发育各时期与花蕾形态的关系，发现小孢子发育时期与花蕾横径、花药颜色变化具有一定对应关性。由此可见，通过花蕾形态特征来判断小孢子发育时期是可行的，可以作为枇杷花药培养的材料选择标准。

在花药培养中，小孢子发育时期与花药培养效率密切相关，研究认为，单核居中期之前的花粉过于幼嫩，双核期之后的花粉太过成熟。对于大多数植物来说，单核靠边期是最适合的小孢子发育阶段[9-10]。本研究也证实了这一点，枇杷花药培养过程中，四分体时期及双核期的小孢子均不能诱导出胚状体，只有单核期的小孢子能诱导出胚状体，其中单核靠边期胚状体诱导率最高，达25.05%。枇杷属于圆锥花序[11]，同一植株不同花序，同一花序不同花蕾，其小孢子的发育进程均有所差异，可以通过使用染色剂如碱性品红、醋酸洋红及DAPI（4'， 6-二脒基-2苯基吲哚）来确定小孢子的发育时期，从而快速进行花药愈伤组织或胚状体的诱导。

3.2 低温处理与枇杷花药愈伤组织诱导

多种预处理方式影响着植物花药愈伤组织的形成，其目的就是从形态上改变其极性分布，从生理生化上改变其细胞生理状态，从而改变其分裂方式和发育途径[12]。对于不同种类、品种和生理状态的植株，花药培养所要求的预处理方式也不同。

Nitsch等[13]在花药培养中首先用低温处理花蕾， 大大提高了花药培养的效率，花药培养中低温处理的有效性在多种植物上得到了证实[14-16]，本试验中，低温处理对花药愈伤组织诱导有极显著的影响，枇杷花药经4 ℃低温处理后，愈伤组织诱导率显著高于对照，当处理时间为48 h时，愈伤诱导率达到了最高的69.93%。随着低温处理时间的延长（>48 h），愈伤组织诱导率大大降低，说明枇杷对低温相对敏感。经深入研究发现低温可以改变纺锤丝的轴向，破坏纺锤丝的微管蛋白，使有丝分裂的正常过程被打破，导致分化过程的发生[17]，并且低温可以在一定程度上抑制花药离体后小孢子的衰败， 使小孢子存活的时间延长， 从而有较多的小孢子启动雄核发育[18]，这一显著差异很可能是低温处理能够大大提高花药愈伤组织诱导率的关键所在。

3.3 外源激素与枇杷花药培养

花药培养中胚状体的发生受多种因素的影响，其中激素仍是最为关键的因素[19]，在花药培养的不同阶段外植体对激素的要求不同。大量试验结果表明，在花药脱分化阶段，外源生长素2，4-D是启动小孢子分裂形成愈伤组织的必要条件[20]，本试验也证实了这点，2，4-D在枇杷花药愈伤组织诱导中起主导作用，这一结论与前人的研究结果一致[21]。而在胚状体诱导阶段应少用或者不用2，4-D，否则对胚状体的发生有抑制作用[22]，因此，花药培养间接胚胎发生途径中，要审慎地改变培养基中的生长调节物质，才有可能改变雄核发育方式，获得胚状体的发生。本试验结果表明，枇杷花药完成脱分化进入胚状体发生阶段时，低浓度的ZT是必需的，将初代培养获得的花药愈伤组织转移到含ZT、NAA与IBA的一定浓度组合的培养基上，获得了25.56%胚状体发生率，高于李俊强等[7]的9.0%，枇杷花药胚状体诱导率的提高，对完善花药胚再生体系，建立枇杷花药胚状体高频再生受体系统具有重要意义。

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