原发性无精症及少精症患者遗传学病因分析*

谢婷婷，王世君

(1.贵州医科大学 临床检验学教研室，贵州 贵阳 550004;2.贵州医科大学附院 临检科，贵州 贵阳 550004)

不孕不育影响着全球大约10%～15%的育龄夫妇，其中近50%归因于男性［1］。导致男性不育的因素排除精索静脉曲张、输精管阻塞、激素水平失衡及感染等因素外，遗传因素引起的生精障碍是导致男性不育的重要原因，表现为原发性无精子症或少精子症［2］，遗传因素包括基因突变和染色体异常，本研究对原发性无精子症或少精子症患者外周血染色体核型和Y 染色体微缺失进行筛查，以了解生精障碍与染色体异常和Y 染色体微缺失的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

原发性无精子症或少精子症患者87 例，45 例为实验1 组，进行外周血染色体核型分析，平均(32.1±6.0)岁，其中无精子症23 例，少精子症22例，严重少精子症10 例;42 例为实验2 组，进行Y染色体微缺失筛查，平均(32.5±5.0)岁，其中无精子症9 例，少精子症33 例，严重少精子症14 例。精液常规正常男性对照50 例为对照1 组，平均(31.1±3.1 岁);40 例为对照2 组，平均(29.5±5.5)岁。原发性无精子症、少精子症纳入标准:参照WHO 标准，连续3 次精液常规检查，离心后沉淀物中均未发现精子者为无精子症，精子密度＜20×109/L 为少精子症，精子密度＜5×109/L 为严重少精子症。

1.2 方法

外周血染色体核型分析:培养外周血淋巴细胞、制备染色体标本并进行Giemsa 染色，每例标本计数15 ～20 个核型，分析4 ～5 个核型，异常核型加倍计数分析。Y 染色体微缺失筛查:应用多重PCR－凝胶电泳技术，酚－氯仿法提取外周血有核细胞基因组DNA，紫外分光光度计鉴定DNA 含量及纯度。参照参考文献［3］设计A、B 两组共7 对基因(STS 片段)引物序列，见表1。建立四重PCR反应体系，琼脂糖凝胶电泳分析PCR 产物。以sY14(SRY)为内对照;正常男性DNA 扩增产物为阳性对照，正常女性DNA 扩增产物为阴性对照。多重PCR 检出位点缺失者，再次行单一PCR-琼脂糖凝胶电泳验证，二者均检出缺失则判定该位点缺失。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 18.0 统计软件分析，计量资料比较采用χ2检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 PCR 引物序列及扩增片段长度Tab.1 Sequences and product length of primers in PCR

2 结果

2.1 外周血染色体核型

实验1 组患者中，染色体核型异常17 例(37.8%)，其中23 例无精子症患者中有13 例(56.5%)，22 例少精子症患者中有4 例(18.2%)。对照1 组中发现染色体核型异常8 例(16.0%)。实验1 组染色体异常检出率显著高于对照1 组，差异有统计学意义(P ＜0.05)，见表2。

2.2 Y 染色体微缺失

实验2 组患者中，5 例(11.9%)有Y 染色体STS 位点的缺失;对照2 组无Y 染色体STS 位点的缺失，见表3。对5 例有Y 染色体STS 位点缺失的患者(标本原始编号为12、44、65、66 及75)进行外周血染色体核型分析发现，5 例患者中，缺失片段均有SY254、SY255(DNA 2)，两例合并其他缺失，3例发现染色体核型异常，见表4。

3 讨论

染色体核型异常是导致男性生精障碍的重要原因之一，有研究报道，无精症患者染色体核型异常检出率为2.1%～58%［4］。本次调查显示，45 例原发性无精子症、少精子症患者中，染色体核型异常检出率(37.8%)明显高于精液常规正常男性(P ＜0.05);特别是在23 例无精子症患者中，染色体核型异常检出率高达56.5%，进一步证明随着生精障碍的加重，染色体核型异常率升高。克氏综合征染色体核型为三体型47，XXY 或嵌合型46，XY/47，XXY，是男性不育患者中最常见的染色体异常，占男性无精子症的10%以上［5］。患者表现为体高，睾丸小而硬，曲细精管玻璃样变性，往往无生育能力。本次调查显示，23 例无精症患者中3例(13.0%)染色体核型为47，XXY 或嵌合型46，XY/47，XXY，而少精子症患者和精液常规正常男性对照未查见克氏征核型，提示克氏征与精子发生障碍密切相关。关于大Y 染色体与精子发生关系的研究报道较少，部分报道认为Yq 异染色质DNA过多的重复可能干扰相邻常染色质区精子发生相关基因功能的正常发挥或减数分裂，从而导致精子生成障碍［6］。本次调查显示，45 例原发性无精子症、少精子症患者与精液常规正常男性比较;差异无统计学意义，这可能与本次研究的检测例数较少或选择标准不同有关。

表2 异常染色体核型及检出率Tab.2 Detection rate of chromosome abnormalities

表3 多重PCR-凝胶电泳技术检测Y 染色体微缺失Tab.3 Y chromosome microdeletions detected by multiplex PCR-gel electrophoresis

表4 Y 染色体微缺失患者染色体核型Tab.4 Chromosome aberrations of patients with Y chromosome microdeletions

1976 年，Tiepolo 等［7］推测Y 染色体上存在控制精子生成的基因－无精子症因子(azoospermia factor，AZF)。目前，已发现Yq 第5、6 间隔区内至少存在AZFa、AZFb、AZFc 和AZFd 4 个互不重叠的区域与精子发生有关［8］，各区域内又包括若干AZF 候选基因，如DBY、DFFRY/USP9Y(AZFa);RBMY1(AZFb);DAZ(AZFc)等，它们的突变或缺失可能引起精子发生异常。AZF 因片段较小，仅可通过PCR 对AZF 区域STSs 进行检测，不同报道的Y 染色体微缺失率相差很大，从1%～55%不等，但大部分研究显示该缺失率低于15%［9］。本次调查显示，对照均无AZF 微缺失，无精症、少精症患者中，有5 例(11.9%)检出有AZF 微缺失，其中，14 例严重少精症患者中2 例(14.3%)有AZF 微缺失;9 例无精症患者中3 例(33.3%)有AZF 微缺失，提示AZFc/DAZ 区为微缺失筛查的热点，AZF 微缺失检测对无精症、少精症的诊治具有重要指导意义。本研究中有Y染色体微缺失的患者中3 例发现Y 染色体数目或结构异常，提示Y 染色体微缺失和染色体核型异常可同时发生，对生精障碍患者应同时进行这两种检查。

综上所述，染色体核型异常和Y 染色体微缺失可能是导致男性生精障碍的重要原因，对男性不育患者进行染色体核型分析和Y 染色体微缺失筛查具有重要的临床意义。

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