重组人血管内皮抑制素联合顺铂对人骨肉瘤MG-63细胞VEGF 基因表达、增殖及侵袭力的影响

张黎明

骨肉瘤是好发于儿童和青少年的常见恶性骨肿瘤，手术及新辅助化疗是其主要治疗手段，但肿瘤早期肺转移及部分患者对化疗耐药是造成综合治疗效果不佳、患者死亡率高的主要原因［1］。研究发现，血管内皮生长因子(VEGF)在骨肉瘤等多种恶性肿瘤组织高表达，是目前发现的诱导肿瘤血管生成、促进肿瘤细胞增殖和转移的关键基因［2］。因此，针对阻断肿瘤血管形成的基因靶向治疗对于控制肿瘤局部浸润及远处转移、提高患者生存率具有重要治疗价值。重组人血管内皮抑制素(rhEndo)是已知具有抗肿瘤作用的血管生成抑制因子［3］，本研究以骨肉瘤MG-63 细胞为研究对象，旨在观察rhEndo 对VEGF 蛋白表达、细胞增殖、凋亡及迁移的影响，为进一步探讨rhEndo 治疗骨肉瘤的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 人骨肉瘤MG-63 细胞购自中科院上海细胞研究所;兔抗人VEGF 单克隆抗体、鼠抗人βactin 单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司;牛血清白蛋白(BSA)、DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自GIBCO 公司;CCK-8 试剂盒购自武汉博士德公司。RT-PCR 试剂盒购自美国Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:在37℃、5% CO2培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM 培养基常规培养人骨肉瘤MG-63 细胞，每2 ～3 天更换1 次培养基，当细胞生长至合适汇合时用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA 消化分散细胞，进行传代培养，待细胞处于对数生长期时用于实验。

1.2.2 RT-PCR:Trizol 提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA 纯度和浓度。取1 μg 总RNA 用RTPCR 试剂盒反转录成cDNA，以此为模板进行后续PCR 扩增。PCR 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，引物序列见表1。扩增完毕后取5 μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪对条带进行扫描分析，以VEGF 与β-actin 灰度值的比值来反映VEGF mRNA 表达水平。

表1 VEGF、β-actin 引物序列

1.2.3 Western blot:提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，定量上样进行10% SDS-PAGE 凝胶电泳，电转移至PVDF 膜上，室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h 或4℃过夜，TBST 洗膜3 次，分别加入稀释后的兔抗人VEGF IgG 和鼠抗人β-actin IgG，室温孵育2 h 或4℃过夜，TBST 洗膜3 次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 显色定影。使用凝胶分析软件对条带进行扫描成像，以VEGF 和βactin 条带灰度值的比值代表VEGF 蛋白相对表达量。

1.2.4 CCK-8 实验:MG-63 细胞接种到96 孔板，调整细胞密度为1 ×104/孔，培养箱中孵育24、48、72 h，将100 μl CCK 加入检测孔内继续培养2 h，用酶标仪于490 nm 波长处测定吸光度值，细胞相对增殖率% =实验组OD 值/对照组OD 值×100%。

1.2.5 流式细胞术:使用流式细胞仪检测Annexin-V+ /PI-比值代表细胞凋亡率。PBS 洗细胞2 次，重悬后调整细胞浓度为1 ×106个/ml，取100 μl 细胞悬液置于流式管中，加入5 μl annexin V-FITC 和10 μl PI溶液，震荡混匀，室温避光孵育15 min;于管中加入300 μl 结合缓冲液，1 h 内上机检测，记录激发波长488 nm 处红色荧光，以百分数表示凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6 Transwell 小室体外迁移实验:细胞生长至对数生长期后消化细胞，分别用PBS、无血清培养基洗涤1次，重悬后调整细胞浓度为2 ×105个/ml，将100 μl 细胞悬液及含10% FBS 的500 μl DMEM 培养基分别接种于上室和下室。37℃培养20 h 后取出小室，弃去上室内液体，用棉签擦拭上室面未迁移的细胞，下室面用结晶紫染色。显微镜下随机计数基底膜下室10 个视野的穿膜细胞数，求取均数即为穿膜细胞数，重复6 次。

1.3 统计学分析 应用SPSS 10.0 统计软件，计数资料采用χ2检验，计量资料以± s 表示，采用t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rhEndo 对细胞VEGF mRNA 和蛋白表达的影响首先我们采用RT-PCR 和Western blot 技术检测1、10、20 μg/ml rhEndo 对细胞VEGF mRNA 和蛋白表达的影响。结果显示，随着rhEndo 浓度增加，VEGF mRNA 和蛋白表达量均逐渐降低，差异有统计学意义(P ＜0.05)，提 示rhEndo 可呈剂量依赖性的抑制VEGF 表达。其中20 μg/ml rhEndo 对VEGF 表达的抑制作用最强，因此，以下实验我们选用的rhEndo 浓度为20 μg/ml。顺铂组、rhEndo、rhEndo 联合顺铂组VEGF 蛋白表达量均较对照组显著降低，差异有统计学意义(P ＜0.05);与顺铂、rhEndo 单药组比较，联合用药组对VEGF 表达的抑制作用更加显著，差异有统计学意义(P ＜0.05)，顺铂与rhEndo 单药组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表2、3。

表2 rhEndo 对细胞VEGF mRNA 和蛋白表达的影响 ± s

表2 rhEndo 对细胞VEGF mRNA 和蛋白表达的影响 ± s

注:与对照组比较，* P ＜0.05;与1 μg/ml rhEndo 组比较，#P ＜0.05;与10 μg/ml rhEndo 组比较，△P ＜0.05

组别 VEGF mRNA 相对表达水平 VEGF 蛋白相对表达水平对照组3.21 ±0.28 2.34 ±0.16 1 μg/ml rhEndo 组 2.56 ±0.18* 1.12 ±0.08*10 μg/ml rhEndo 组 1.79 ±0.15＊△ 0.61 ±0.05* #20 μg/ml rhEndo 组 0.96 ±0.08＊△ 0.28 ±0.03＊△

表3 4 组VEGF mRNA 和蛋白表达比较 ± s

表3 4 组VEGF mRNA 和蛋白表达比较 ± s

注:与对照组比较，* P ＜0.05;与顺铂组和rhEndo 组比较，#P ＜0.05

组别 VEGF mRNA 相对表达水平 VEGF 蛋白相对表达水平对照组3.21 ±0.28 2.34 ±0.16顺铂组 1.04 ±0.11* 0.32 ±0.06*rhEndo 组 0.96 ±0.08* 0.28 ±0.03*rhEndo 联合顺铂组 0.41 ±0.05* # 0.13 ±0.02*#

2.2 细胞增殖、凋亡情况比较 我们采用CCK-8 实验和流式细胞术分别检测不同时间点各组细胞增殖和凋亡情况。结果显示，顺铂组、rhEndo 组、rhEndo 联合顺铂组细胞相对增殖率均较对照组显著降低，凋亡率均较对照组显著增加，差异有统计学意义(P ＜0.05);与顺铂、rhEndo 单药组比较，联合用药组细胞相对增殖率和凋亡率变化更加显著，差异有统计学意义(P ＜0.05)，顺铂与rhEndo 单药组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表4、图1。

表4 4 组细胞增殖、凋亡情况比较 ± s

表4 4 组细胞增殖、凋亡情况比较 ± s

注:与对照组比较，* P ＜0.05;与顺铂组和rhEndo 组比较，#P ＜0.05

组别 相对增殖率(%)24 h 48 h 72 h 凋亡率(%)1.22±0.03 1.39±0.02 1.51±0.05 0.57±0.01顺铂组 1.15±0.03* 1.31±0.03* 1.37±0.05* 6.74±0.47*rhEndo 组 1.14±0.02* 1.30±0.02* 1.35±0.04* 7.02±0.49*rhEndo 联合顺铂组 1.08±0.01* # 1.18±0.03* # 1.20±0.02* # 13.21±1.02*#对照组

图1 CCK-8 检测各组24 h、48 h 及72 h 增殖情况

2.3 细胞侵袭迁移情况比较 Transwell 小室体外迁移实验检测细胞侵袭迁移能力。结果显示，顺铂组、rhEndo 组、rhEndo 联合顺铂组侵袭细胞数均较对照组显著降低，差异有统计学意义(P ＜0.05);与顺铂、rhEndo 单药组比较，联合用药组侵袭细胞数降低更加显著，差异有统计学意义(P ＜0.05)，顺铂与rhEndo单药组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表5。

表5 4 组细胞侵袭迁移情况比较 ± s

表5 4 组细胞侵袭迁移情况比较 ± s

注:与对照组比较，* P ＜0.05;与rhEndo 组比较，#P ＜0.05

组别 侵袭细胞数对照组65.48 ±5.22顺铂组 43.11 ±3.25*rhEndo 组 40.76 ±3.17*rhEndo 联合顺铂组 19.53 ±2.04*#

3 讨论

骨肉瘤是一种恶性程度极高的原发性骨肿瘤，其发病率居儿童、青少年恶性骨肿瘤的首位［4］。经截肢进行广泛切除手术后患者的10 年生存率仅为15%，即使采取联合新辅助化疗和截肢治疗仍不能进一步提高患者生存率，这主要是因为约40%的患者已经发生肺转移，这是该病死亡率和复发率高、预后差的主要原因［5，6］。近年来，有关骨肉瘤转移机制及抗转移疗法的研究和探索成为肿瘤研究领域的热点，这对于防治骨肉瘤进而提高患者生存率至关重要。然而，目前尚无效果理想的抗转移疗法。因此，寻找有效的治疗靶点及措施是减少肺转移发生及治疗骨肉瘤的关键。

研究显示，恶性肿瘤的生长、浸润与转移与新生血管的生成密切相关，不仅为癌细胞生长提供丰富的营养，还为癌细胞扩散和转移提供了血管通路［7］。临床试验表明，骨肉瘤患者术后促血管生成因子与血管生成抑制因子表达失衡，与早期肺转移发生密切相关［8］。基础实验也证实裸鼠围手术期抑制新生血管的生成能够明显减少肿瘤肺转移的发生［9］。VEGF 是肿瘤血管形成中的关键因子，是目前已知作用最强的促血管生成因子。研究显示VEGF 在胃癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤组织异常高表达，参与肿瘤细胞的抗凋亡及侵袭转移过程［10］。VEGF 通过自分泌或旁分泌的方式发挥刺激血管内皮细胞增殖分化、促进肿瘤血管形成、抑制肿瘤细胞凋亡的作用，同时还使血管通透性增加，为癌细胞的浸润和转移提供血管支持物。Rastogi 等［11，12］采用ELISA 法和免疫组化法检测骨肉瘤患者血清和肿瘤组织VEGF 表达状况，结果显示，与健康正常人比较骨肉瘤患者VEGF 表达水平显著增高，化疗后患者VEGF 表达水平明显降低，且发生肺转移者VEGF 表达水平明显高于未发生肺转移者，提示VEGF 表达水平不仅对于骨肉瘤诊断具有参考价值，而且可以作为判断肿瘤复发、转移及预后不良的分子标志物。由此可见，靶向VEGF 和血管生成的治疗措施具有广泛的应用前景和治疗意义。

rhEndo 作为一种新型、强效血管生成抑制剂，已于2005 年上市并广泛应用于骨肉瘤、小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的临床治疗。临床研究证实，rhEndo 与化疗药物联用能够增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，发挥协同抗肿瘤作用，改善患者预后［13］。其作用机制是通过特异性阻断VEGF/VEGFR 信号途径从而抑制血管内皮细胞的分裂、增殖和迁移以及血管、淋巴管生成，最终产生抑制肿瘤生长和侵袭转移的作用。

本研究中我们采用RT-PCR 和Western blot 检测rhEndo 联合顺铂对骨肉瘤MG-63 细胞VEGF mRNA和蛋白表达的影响以及细胞体外增殖能力、凋亡情况及迁移能力的变化，由此推断VEGF 在骨肉瘤增殖、侵袭及转移过程中的作用，并进一步探讨rhEndo 治疗骨肉瘤的可能作用机制。RT-PCR 和Western blot 结果显示，与对照组比较，顺铂组、rhEndo 组以及rhEndo 联合顺铂组MG-63 细胞VEGF mRNA 和蛋白水平均有不同程度降低;与单药相比，联合用药能够显著抑制VEGF mRNA 和蛋白表达，较单药组差异有统计学意义(P ＜0.05)，提示rhEndo 除了作用于肿瘤组织中的血管内皮细胞外，也能直接下调肿瘤细胞VEGF 的表达抑制血管生成。CCK-8 结果显示，rhEndo 组、顺铂组及rhEndo 联合顺铂组细胞增殖率均较对照组降低，细胞凋亡率均较对照组升高，表明肿瘤细胞的增殖力明显减弱;而联合用药组细胞增殖率最低，凋亡率最高，较单药组差异有统计学意义(P ＜0.05)，提示联合用药组抑制骨肉瘤细胞的增殖具有协同作用。Transwell 小室实验结果也显示，rhEndo 组、顺铂组及rhEndo 联合顺铂组穿膜细胞数量均较对照组减少，表明肿瘤细胞的侵袭力明显减弱;而联合用药组穿膜细胞数最少，较单药组差异有统计学意义(P ＜0.05)，提示联合用药组抑制骨肉瘤细胞的侵袭力具有协同作用。由此可见，rhEndo 联合顺铂用药时，能进一步增强顺铂抑制肿瘤细胞增殖和侵袭﹑诱导细胞凋亡的作用，具有更为显著的抗肿瘤效应。

总之，鉴于VEGF 在骨肉瘤发病机制中的作用，针对VEGF 的分子靶向治疗必将成为抗肿瘤新的研究方向和热点。本研究结果表明，抗肿瘤血管生成治疗对于骨肉瘤具有显著疗效，重组人血管内皮抑制素联合顺铂方案可能成为骨肉瘤治疗的新策略，尤其对于出现转移和对化疗耐药的患者，重组人血管内皮抑制素有可能具有更大的治疗价值。

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