混凝土修复功能菌Bacilluscohnii DSM6307芽孢发酵条件优化

柯金龙，彭 慧，刘 冰，邓 旭，邢 锋

1)深圳大学生命科学学院，深圳518060; 2)深圳大学土木工程学院，深圳518060

【生物工程 / Bioengineering】

混凝土修复功能菌BacilluscohniiDSM6307芽孢发酵条件优化

柯金龙1，彭 慧1，刘 冰1，邓 旭1，邢 锋2

1)深圳大学生命科学学院，深圳518060; 2)深圳大学土木工程学院，深圳518060

对嗜碱科式芽孢杆菌(alkaliphilicBacilluscohnii, DSM6307)芽孢形成的影响因素进行了研究.单因素实验结果表明，蔗糖为最适碳源，最佳质量浓度为1.0 g/L；牛肉膏为最适氮源，最佳质量浓度为3.0 g/L；Mn2+最适质量浓度为3.2 mg/L；Mg2+最适质量浓度为0.12 g/L；最适温度为30 ℃；装液量为50 mL (250 mL锥形瓶)．运用Plackett-Burman法研究了碳源、氮源、微量元素、温度和装液量5个因素对DSM6307产芽孢数的影响，结果表明，碳源、氮源和Mn2+是影响DSM6307芽孢产量的显著因子.运用中心组合设计实验对这3种显著因子进行优化后，应用响应面模型测出蔗糖、牛肉膏和Mn2+的最优质量浓度分别为1.30 g/L、3.29 g/L和11.48 mg/L，预测芽孢数为1.67×109mL-1.在此优化条件下，实验得到的芽孢数为1.50×109mL-1，与预测值接近.

矿化微生物；嗜碱芽孢杆菌；芽孢形成；优化条件; Plackett-Burman设计；中心组合设计

混凝土裂缝的微生物修复是一种新型修复技术，其机理是利用自然界普遍存在的矿化微生物的新陈代谢，生成一些以碳酸钙为代表的相对不溶或难溶的化合物，对修复混凝土材料进行修复.目前，荷兰Delft大学[1]和比利时Ghent大学[2-3]基于微生物矿化的机理，在微生物自修复方面均取得较好的进展.由于微生物的营养细胞不能耐受混凝土搅拌时的高速剪切力，并难以度过混凝土的水化期，因此，将微生物用于混凝土内部裂缝自修复时不能直接以营养细胞的形式预埋.为此，Jonkers等[4]开创性地选择以细菌芽孢的形式埋入混凝土.与营养细胞相比，芽孢因其特殊的生理结构与功能更能承受混凝土成型搅拌时的高速冲击力以及内部的强碱环境，且水化后的混凝土内部是一个相对干燥的封闭环境，休眠状态的芽孢可长期存活其中.当混凝土裂缝出现时，进入裂缝的水分和空气触发休眠芽孢萌发形成营养细胞，营养细胞通过新陈代谢作用并利用混凝土富含的钙源生成碳酸钙以修复裂缝.当裂缝修复完毕后，又在内部产生新的芽孢休眠体，等待下一次修复的启动.Jonkers等[5]的研究表明，芽孢预埋数量为1.14×109mL-1时，基本不会影响混凝土的抗拉和抗压能力.考虑到混凝土的高强碱性环境，用于混凝土自修复的微生物多为嗜碱性芽孢杆菌[6].目前国内外对巴氏芽孢杆菌[7]和巴士芽孢八叠球菌的研究较多[8].

为满足工业化应用，必须优化用于混凝土裂缝修复的微生物芽孢发酵的条件，大幅提高芽孢产量.影响芽孢产量的因素众多，因此，采用科学合理的实验方法对各因素进行优化十分必要.以往对芽孢方面的研究主要集中在畜牧、水产、医药、保健和食品等行业，研究内容也基本以休眠芽孢在特定条件下的复苏为主，如何有效提高芽孢生成产率鲜有涉及.本研究通过单因素优化试验考察了碳源、氮源、微量元素、装液量和温度对科氏芽孢杆菌芽孢形成的影响，并进一步采用Plackett-Burman(PB)设计法[9]和响应面优化分析法求得最佳的芽孢发酵条件，获取最大产量的芽孢，为后期芽孢参与混凝土裂缝修复奠定实验基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌 种

嗜碱科氏芽孢杆菌(alkaliphilicBacilluscohnii, DSM6307)，由荷兰代尔夫特理工大学提供.

1.1.2 种子培养基(1 L)

5.000 g牛肉膏、3.000 g蛋白胨、0.530 g Na2CO3和0.420 g NaHCO3.

1.1.3 初始芽孢发酵培养基(1 L)

0.020 g 磷酸二氢钾、0.225 g 二水氯化钙、0.200 g 氯化钾、0.200 g 六水氯化镁、0.010 g 一水硫酸锰、1.000 g 酵母粉、0.375 g 硝酸钾、0.200 g 氯化铵、10 mmol/L 乳酸钠(单独灭菌)和5.300 g 碳酸钠/4.200 g 碳酸氢钠(单独灭菌).

1.1.4 单因素优化发酵培养基(1 L)

根据试验需要在基础培养基中添加碳源、N源配制优化培养基.基础培养基： 0.020 g 磷酸二氢钾、0.225 g 二水氯化钙、0.200 g 氯化钾、 0.200 g 六水氯化镁、 0.010 g一水硫酸锰、 5.300 g碳酸钠/4.200 g 碳酸氢钠.

碳源优化培养基：在基础培养基中分别添加质量浓度为1.0 g/L的不同碳源，如蔗糖、麦芽糖、淀粉、甘露糖和葡萄糖，然后再添加1.000 g 酵母粉、0.375 g 硝酸钾和0.200 g 氯化铵，配制成5种不同碳源种类的优化培养基；获得最佳碳源后，基于碳源培养基，配制质量浓度分别为0.5、1.0、4.0、7.0、10.0、13.0、16.0和20.0 g/L的碳源优化培养基.

氮源优化培养基：在基础培养基中分别添加质量浓度为3.0 g/L的不同氮源，如牛肉膏、蛋白胨、氯化铵、硝酸铵、尿素和硝酸钠，再添加10.0 mmol/L的乳酸钠，配制氮源种类优化培养基；获得最佳氮源后，基于氮源培养基，配制成8种质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 g/L的氮源优化培养基.

微量元素优化培养基：以初始芽孢发酵培养基为基础，通过改变MgCl2·6H2O的质量浓度，配制出Mg2+质量浓度分别为0.06、0.12、0.24和0.36 g/L的Mg2+优化培养基；通过改变MnSO4·H2O的浓度，配制出Mn2+质量浓度分别为1.6、3.2、6.5、9.8、13.0和16.0 mg/L的Mn2+优化培养基.

1.2 实验方法

1.2.1 活化和种子培养

从-80 ℃冰箱取出菌种，按0.1%(体积分数)接种至30 mL种子培养基中，于30 ℃ 150 r/min 培养24 h后，接入100 mL种子培养基中扩大培养，以备后用.

1.2.2 单因素优化芽孢发酵培养

将种子培养液按1%(体积分数)接种至碳源、氮源和微量元素优化培养基中，装液量和温度的优化使用初始芽孢发酵培养基，250 mL三角瓶分装50 mL，30 ℃ 150 r/min培养4 d后，利用细菌计数板计数[10].

1.2.3 Plackett-Burman设计

根据DSM6307芽孢形成条件，通过单因素实验探究，选取11个因素，每个因素分为两个水平类，因素低水平用“-1”表示，因素高水平用“1”表示(表1).

表1 Plackett-Burman设计

1.2.4 中心组合设计

依据单因素实验、PB设计所确定的显著影响因素及最佳的取值范围，进行中心组合设计实验.

2 结果与讨论

2.1 单因素对DSM63076307芽孢形成的影响

2.1.1 碳 源

在培养基成分中，碳源及其浓度是影响芽孢形成的主要因素[11].考察5种不同碳源的影响，结果如图1(a). 由图1(a)可见，DSM6307对各种碳源均可以利用，以蔗糖为碳源时芽孢的产量最高，比对照组(以乳酸钠为碳源)芽孢数高55.47%.但以甘露醇和葡萄糖为碳源时，芽孢产量较低.从成本及效果等方面考虑，选取蔗糖为最佳碳源.

图1(b)是不同蔗糖质量浓度下芽孢的生成情况.以1.0 g/L的蔗糖为碳源时，其产芽孢数最高，达1.24×109mL-1.总体来看，低质量浓度的蔗糖(0.5和1.0 g/L)更利于芽孢的生成，这可能是由于高质量浓度导致营养条件更为优越，使得已形成的芽孢进一步萌发.

图1 碳源和蔗糖质量浓度对DSM6307芽孢形成的影响Fig.1 Influences of carbon source and sucrose concentration on the DSM6307 spore formation

2.1.2 氮 源

培养基中的氮源也影响芽孢的形成[11].图2(a)的结果表明，以牛肉膏为氮源时产芽孢数最高，达1.55×109mL-1，比对照组(酵母粉为氮源)高85.77%；以蛋白胨为氮源时，产芽孢数达1.20×109mL-1，较对照组增加了81.68%；以氯化铵和硝酸铵为氮源时，产芽孢数较对照组分别增加了70.55%和57.75%；而以硝酸钠和尿素为氮源时，芽孢产量与对照组基本持平.t检验也证明以硝酸钠和尿素为氮源与对照组无明显区别.显然，与无机氮源相比，有机氮源更有利于芽孢的形成.综合各方面考虑，确定牛肉膏为最佳氮源.此结果与文献[12]的部分研究结果相近.

图2 氮源和牛肉膏质量浓度对DSM6307芽孢形成的影响Fig.2 Influences of nitrogen source and beef extract concentration on the DSM6307 spore formation

与碳源不同，高质量浓度的氮源似乎更利于芽孢形成.从图2(b)来看，DSM6307芽孢数随牛肉膏质量浓度的增加基本呈上升趋势，当氮源质量浓度为3.0g/L时，芽孢产量最高，达1.67×109mL-1.随着牛肉膏质量浓度进一步增加，芽孢数量却出现下降.

碳和氮源都是微生物生长必不可少的营养物质，但两者质量浓度对芽孢的影响差异较大，可能是因为碳源一般是作为细胞生长的能量物质，在芽孢没有萌发前需求不大；而氮源的主要功能是为细胞合成包括DNA在内的各种成分提供骨架，这对于芽孢的形成是必不可少的.

2.1.3 微量元素

图3 ρ(Mn2+)和ρ(Mg2+)对DSM6307芽孢形成的影响Fig.3 Influences of manganese ion and magnesium ion on the DSM6307 spore formation

作为细胞生长必需的微量元素，Mg2+和Mn2+对营养体的生长和芽孢的形成影响都较大，但不同种类微生物表现结果各不相同[13].图3实验结果表明，随着质量浓度的变化，两种离子对芽孢生成的影响均呈先升后降趋势，且都存在最佳质量浓度，ρ(Mg2+)=0.12 g/L时，芽孢数为7.20×108mL-1；ρ(Mn2+)=3.2 mg/L时，芽孢数最多，为5.20×108mL-1.

一般认为，Mg2+作为己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氧酶的活性中心组分，有利于细胞营养体生长，但不利于芽孢的形成.重金属元素Mn2+可能会对微生物有毒害作用，从而触发营养细胞的应激机制导致芽孢的形成.已有研究表明，芽孢数会随ρ(Mn2+) 增加而增加，在某一质量浓度时，芽孢数达到峰值，随后下降[14]，这与本研究结果一致.

2.1.4 装液量

DSM6307是一株好氧菌，生长过程需要氧的摄入.在转速相同时，装液量多少反映培养液中溶氧水平的高低.图4结果表明，随着装液量的增加，芽孢数呈下降趋势.250 mL锥形瓶的装液量为1/5(50 mL)时，芽孢数最高，为5.20×108mL-1.当装液量为4/5(200 mL)时，芽孢数急剧下降，说明足够的溶氧对芽孢形成十分重要.

图4 装液量对DSM6307芽孢形成的影响Fig.4 Influence of the loading volume on the DSM6307 spore formation

2.1.5 温 度

图5 温度对DSM6307芽孢形成的影响Fig.5 Influence of the temperature on DSM6307 spore formation

温度对芽孢形成也有影响[13].DSM6307在生长范围内芽孢数随温度升高呈先升后降趋势.从20 ℃上升至30 ℃时，芽孢数达到最大值，为5.72×108mL-1；上升到50 ℃时，芽孢数急剧下降，显微镜下观察几乎没有芽孢，营养体数目也极少.过高的温度使得营养体难以存活，直接扼杀了芽孢在营养体内的形成.

2.2 PB实验结果

在单因素实验结果的基础上，通过PB设计法对各影响因素进行比较，以找出影响芽孢形成的关键因素(表2).

表2 PB法实验结果1)

1)-表示无意义

表2显示，实验设计P=0.006 8<0.05时，该设计有意义.ρ(蔗糖)、ρ(牛肉膏)和ρ(Mn2+)的P值分别为0.010 9、0.014 8和0.017 8，均小于0.05，说明这3个因素影响显著，相比之下，其他因素为非显著影响因素；R2=0.783 3，表明该模型能够解释78.33%的实验结果，结果可靠. 因此，ρ(蔗糖)、ρ(牛肉膏)和ρ(Mn2+)为影响DSM6307芽孢形成的关键因子，可进行下一步响应面优化.

2.3 中心组合设计

针对PB实验得出的3个关键影响因素，利用中心组合设计法(表3)进一步分析，结果见表4.

表3 中心组合设计

由表4可知，失拟值的F=3.71，P>0.05，差异不显著；总模型的F=244.67，R2=0.995 5，P<0.001，达到非常显著水平，表明该模型能较好地进行模拟预测.表4中各项指标的P值均小于0.05，说明3个关键因素对芽孢形成的影响均有统计学意义.

表4 中心组合设计方差分析结果1)

1)-表示无意义

不同因素之间的相互作用对芽孢产率的影响可用等高线表示.等高线的形状显示两种因素之间相互作用的强弱，等高线为圆形说明这两种因素之间相互作用不显著，椭圆形则表明这两种因素之间具有较强的相互作用.图6的等高线都呈椭圆形，说明ρ(蔗糖)与ρ(牛肉膏)、ρ(蔗糖)与ρ(Mn2+)以及ρ(牛肉膏)与ρ(Mn2+)间的相互作用都较强，但ρ(牛肉膏)与ρ(Mn2+)之间的相互作用较其他两种因素相对较弱.

通过中心组合设计实验可拟合出芽孢数与3种关键因素之间的模型方程：

Y=1.172×109+2.729×107P1-3.635× 107P2-5.545×107P5-4.587× 107P1P2+4.588×107P1P5-1.962× 107P2P5-4.401×107P12-1.442× 108P22-1.603×108P52

(1)

其中，Y为预测芽孢数；P1、P2和P5分别为ρ(蔗糖)、ρ(牛肉膏)和ρ(Mn2+)作用后产芽孢数.

由式(1)预测出各因素最优的组合为：ρ(蔗糖)=1.30g/L、ρ(牛肉膏)=3.29g/L、ρ(Mn2+)=11.48mg/L，该条件下预测芽孢数为1.67×109mL-1.在CCD-RSM求得的最佳条件下，对DSM6307进行产芽孢发酵实验，结果为1.50×109mL-1，与预测值相差10.18%，具有可信度.

图6 影响因子对芽孢形成影响的等高线Fig.6 (Color online) Contours of the influence factors on DSM6307 spore formation

结 语

本研究对用于混凝土裂缝自修复的嗜碱芽孢杆菌芽孢产率的影响因素进行了系统地考察.通过单因素法分析了碳源、氮源、微量元素、温度和装液量等因素的影响，利用Plackett-Burman法从上述影响因素中筛选出ρ(蔗糖)、ρ(牛肉膏)和ρ(Mn2+)为3个影响DSM6307芽孢形成的显著因子，经中心组合设计实验及响应面模型得出蔗糖、牛肉膏和Mn2+的最优质量浓度分别为1.30g/L、3.29g/L和11.48mg/L，预测芽孢数为1.67×109mL-1.实验得到的芽孢数为1.50×109mL-1，高于单因素优化结果，提高了芽孢产量. 今后将从以下方面开展深入研究：① 利用平板菌落计数法研究芽孢存活率；② 寻找芽孢产率更高的菌株；③对如何提高芽孢预埋混凝土后的活性进行探究.

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【中文责编：晨 兮；英文责编：艾 琳】

Optimization of spore production condition of concrete self-healing bacteriumBacilluscohniiDSM6307

Ke Jinlong1, Peng Hui1, Liu Bing1, Deng Xu1†, and Xing Feng2†

1) College of Life Science, Shenzhen University, Shenzhen 518060, P.R.China 2) College of Civil Engineering , Shenzhen University, Shenzhen 518060, P.R.China

This paper investigates the influential factors of the spore production of alkaliphilicBacilluscohnii(DSM6307).Firstly,weemployedasinglefactoroptimizationmethodandobtainedtheresultsthattheoptimumcarbonsourceissucrosewiththesuitableconcentrationof1.0g/L;theoptimumnitrogensourceisabeefextractwithasuitableconcentrationof3.0g/L;theoptimalconcentrationofMn2+is3.2mg/L,andtheoptimalconcentrationofMg2+is0.12g/L;thesuitabletemperatureis30 ℃,andtheloadingvolumeis50mLina250mLconicalflask.ThenthePlackett-Burmandesignoftheexperimentrevealsthatthecarbonsource,nitrogensourceandMn2+arethesignificantfactorsamongthe5factorsofcarbonsource,nitrogensource,microelementlevel,temperatureandtheloadingvolume.Finally,weperformedfurtheroptimizationwithcentralcompositedesignandresponsesurfaceanalysis,anditisfoundthatthesporeproductionofDSM6307is1.67×109mL-1withoptimizedconcentrationsofsucrose,beefextractandMn2+being1.30g/L, 3.29g/Land11.48mg/L,respectively.Undersuchoptimizedconditions,theactualsporeproductioninourexperimentis1.50×109mL-1andisclosetothepredictedone.

mineralized microbes; alkaliphilicBacillussp.; spore forming; condition optimization; Plackett-Burman design；central composite design

：Ke Jinlong, Peng Hui, Liu Bing, et al. Optimization of spore production condition of concrete self-healing bacteriumBacilluscohniiDSM6307[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2015, 32(2): 145-151.(in Chinese)

X 524

A

10.3724/SP.J.1249.2015.02145

国家自然科学基金委国际(地区)合作与交流项目(51120185002)

柯金龙(1989—),男(汉族), 安徽省安庆市人，深圳大学硕士研究生.E.mail：565401695@qq.com

Received：2014-09-24；Accepted：2014-12-06

Foundation：Funds for International Cooperation and Exchange of the National Natural Science Foundation of China(51120185002)† Corresponding author：Professor Deng Xu, E-mail:dengxu@szu.edu.cn; Professor Xing Feng, E-mail: xingf@szu.edu.cn

引 文：柯金龙，彭 慧，刘 冰，等. 混凝土修复功能菌BacilluscohniiDSM6307芽孢发酵条件优化[J]. 深圳大学学报理工版，2015，32(2)：145-151.