梓醇抑制AGEs诱导的EA.hy926细胞炎症反应及RAGE表达*

刘江月(潍坊医学院病理生理教研室，山东潍坊261053)

梓醇抑制AGEs诱导的EA.hy926细胞炎症反应及RAGE表达*

刘江月△
(潍坊医学院病理生理教研室，山东潍坊261053)

［摘要］目的:研究梓醇对晚期糖基化终产物(AGEs)诱导的EA.hy926内皮细胞炎症反应的抑制作用并探讨其可能机制。方法:将常规培养的EA.hy926细胞随机分为对照组、梓醇对照组、AGEs组以及梓醇高剂量(0.5 mmol/L)、中剂量(0.25 mmol/L)和低剂量(0.05 mmol/L)保护组。激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧簇(ROS)的生成; RT-PCR和Western blot检测细胞中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)及晚期糖基化终产物受体(RAGE)的mRNA及蛋白的表达。结果:梓醇保护组ROS生成均明显减少，MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA及蛋白表达均显著降低，RAGE蛋白表达明显受抑制，且呈剂量依赖性(P＜0.05)。结论:梓醇能够有效抑制AGEs诱导的EA.hy926细胞内氧化应激，减轻炎症反应，其机制可能与其降低RAGE表达有关。

［关键词］梓醇;氧化应激;炎症反应;晚期糖基化终产物受体

糖尿病大血管病变是是糖尿病相关心脑血管疾病的基础，基本病理改变是动脉粥样硬化。晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)是蛋白质、脂类的氨基与糖的醛基之间发生非酶性糖化氧化反应的终产物，与糖尿病大血管病变的发生发展密切相关。研究已经证实AGEs最主要的致病机制是与晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)相互作用所介导的，AGEs能明显增强内皮细胞中血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)及细胞间黏附分子1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表达，抗RAGE抗体及sRAGE阻断RAGE能明显抑制这些黏附分子表达［1-2］。同时有研究显示在AGEs-RAGE相互作用诱导的糖尿病血管病变中，大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的诱导生成是关键步骤［3-4］。梓醇是从地黄块根中提取的小分子环烯醚萜类化合物［5］，具有多种药理学作用如降血糖、抗肿瘤、保护神经［6-8］等。我们在前期研究中发现，梓醇能够抑制ROS生成减轻糖尿病大血管损伤［9］。本研究通过观察梓醇是否能抑制RAGE的生成，降低AGEs-RAGE相互作用诱导的内皮细胞ROS产生，进而是否减轻炎症反应的发生。

材料和方法

1材料

1.1细胞株与药物人脐静脉内皮细胞株EA.hy926购自上海拜力生物科技有限公司;梓醇标准品(纯度≥98%)购于上海铭睿科技有限公司。

1.2主要试剂AGEs(Merk) ; DMEM低糖培养基(Gibco) ;胎牛血清(HyClone) ;胰蛋白酶(Sigma) ; 2'，7'-二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA)试剂盒、Western blot相关试剂及MCP-1、TNF-α、VCAM-1、RAGE RT-PCR试剂盒(碧云天生物技术研究所) ; MCP-1、TNF-α、VCAM-1和RAGE I抗(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3主要仪器752型紫外分光光度计(上海精密仪器有限公司) ; DYCZ-25D型电泳仪(北京市六一仪器厂) ; Bio-Rad型湿转仪(Bio-Rad) ;激光共聚焦显微镜(Olympus)。

2方法

2.1激光共聚焦显微镜观察EA.hy926细胞ROS的生成生长良好的EA.hy926细胞接种于6孔板，实验分为对照组(A组)、梓醇组(B组，0.5 mmol/L)、AGEs组(C组，200 mg/L)以及高剂量(D组，0.5 mmol/L)、中剂量(E组，0.25 mmol/L)和低剂量(F组，0.05 mmol/L)梓醇保护组。除A组外，其余各组先加入不同浓度梓醇孵育4 h后，C、D、E、F组分别再加入终浓度200 mg/L的AGEs培养30 min，弃培养液，用PBS洗3次，用无血清培养基按1∶1 000稀释DCFH-DA，按照细胞培养液量的一半加入细胞，37℃孵育30 min。无血清培养液洗涤细胞3次后，488 nm激光激发，激光共聚焦显微镜直接观察。

2.2 RT-PCR检测梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞MCP-1、TNF-α、VCAM-1和RAGE的mRNA表达

将生长良好的EA.hy926细胞接种于6孔板，除A组外，其余各组先加入不同浓度梓醇孵育24 h后，C、D、E、F组分别再加入终浓度200 mg/L的AGEs培养24 h，收集细胞，按说明书操作提取总RNA，合成cDNA，2 μL的cDNA为模板，GAPDH为内参照，进行PCR扩增，引物设计见表1。

表1　引物序列Table 1.The sequences of the primers

2.3Western blot检测梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞MCP-1、TNF-α、VCAM-1和RAGE蛋白的表达

将生长良好的EA.hy926细胞接种于6孔板，除A组外，其余各组先加入不同浓度梓醇孵育24 h后，C、D、E、F组分别再加入终浓度200 mg/L的AGEs培养24 h，收集细胞，提取总蛋白，SDS-PAGE电泳后切取目的条带进行转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后加I抗(1∶500)，4℃过夜，TBST漂洗3次，加入II抗孵育1 h，化学发光反应，显影定影，图像分析。

3统计学处理

应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析比较组间差异，两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞ROS生成的影响

与A组比较，B组的ROS生成无明显变化，C组的ROS生成显著增加(P＜0.05) ;与C组比较D、E、F各组的ROS均明显降低(P＜0.05)，与E组比较，D组的ROS生成明显减少(P＜0.05)，而F组的ROS生成明显增多(P＜0.05)，说明梓醇对EA.hy926细胞ROS的生成无影响，对AGEs诱导的EA. hy926细胞生成ROS呈明显剂量依赖性抑制作用，见图1。

Figure 1.The effect of catalpol on ROS production in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.图1梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞内ROS生成的影响

2梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1 mRNA表达的影响

与A组比较，B组的MCP-1、TNF-α和VCAM-1 的mRNA表达均无明显变化(P＜0.05)，C组的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表达均显著增高;与C组比较，D、E、F各组的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表达均明显减少(P＜0.05) ;与E组比较，D组的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表达明显降低(P＜0.05)而F组的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表达明显升高(P＜0.05)，说明梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表达的影响呈明显剂量依赖性，见图2。

3梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1蛋白表达的影响

与A组比较，B组的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表达均无明显变化(P＜0.05)，C组的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表达均显著升高;与C组比较，D、E、F各组的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表达均明显减少(P＜0.05) ;与E组比较，D组的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表达明显降低(P＜0.05)而F组的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表达明显升高(P＜0.05)，说明梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞的MCP-1、TNF-α和VCAM-1蛋白表达的影响呈明显剂量依赖性，见图3。

Figure 2.The effect of catalpol on the mRNA expression of MCP-1，TNF-α and VCAM-1 in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.图2梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1 mRNA表达的影响

4梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞RAGE的mRNA及蛋白表达的影响

与A组比较，B组RAGE的mRNA及蛋白表达无明显变化，C组RAGE的mRNA及蛋白表达均明显上调(P＜0.05) ;与C组比较，D、E、F组RAGE的mRNA及蛋白表达均明显受抑制(P＜0.05) ;与E组比较，D组RAGE的mRNA及蛋白表达明显受抑制(P＜0.05)而F组RAGE的mRNA及蛋白表达明显上调(P＜0.05)，说明梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞RAGE的mRNA及蛋白表达的影响呈明显剂量依赖性，见图4、5。

讨论

AGEs在糖尿病中研究较多，体内AGEs慢性蓄积与动脉粥样硬化之间有明显因果关系，是糖尿病血管病变的触发因素［10-12］。RAGE是存在于内皮细胞表面的AGEs特异性受体，它与AGEs的结合可引起内皮细胞多种功能障碍，是引起糖尿病血管疾病的重要因素［13］。AGEs与RAGE结合诱导细胞内氧化应激和ROS产生增加，本研究也发现AGEs诱导的EA.hy926细胞RAGE表达明显升高同时细胞内ROS大量产生。Choi等［14］研究发现梓醇能够抑制AGEs诱导的THP-1细胞ROS的大量生成;杨清俊等［15］研究也发现梓醇能够抑制高糖诱导的氧化应激。本研究采用不同浓度梓醇进行干预，结果也发现梓醇呈剂量依赖性抑制AGEs诱导的EA.hy926细胞内ROS的产生，这与我们的前期结果及前人的研究是一致的［9］。Choi等［14］研究表明梓醇明显抑制RAGE表达，本研究结果也发现梓醇呈剂量依赖性抑制RAGE的表达，说明梓醇可能是通过抑制RAGE表达，阻断了AGEs-RAGE的相互作用，从而抑制了细胞内ROS的大量生成，抑制氧化应激。

Figure 3.The effect of catalpol on the protein expression of MCP-1，TNF-α and VCAM-1 in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol control group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.图3梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1蛋白表达的影响

Figure 4.The effect of catalpol on the mRNA expression of RAGE in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol control group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.图4梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞RAGE mRNA表达的影响

Figure 5.The effect of catalpol on the protein expression of RAGE in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol control group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.图5梓醇对AGEs诱导EA.hy926细胞RAGE蛋白表达的影响

AGEs-RAGE的相互作用能诱导细胞内氧化应激，ROS产生增强，产生的ROS反过来又激活多种信号转导通路，通过级联放大反应，进一步调节多种基因的转录表达，其中大多数是与炎症、免疫及动脉粥样硬化相关的，如细胞因子(IL-6、TNF-α)、生长因子(TGF-β、VEGF、IGF、PDGF)、黏附分子(VCAM-1、ICAM-1)和组织因子(tissue factor，TF)，促进糖尿病血管病变的发生和发展［16］。多项研究发现［14，17］梓醇能抑制多种细胞炎症因子的释放，本研究发现梓醇剂量依赖性地抑制AGEs诱导的EA.hy926细胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA和蛋白的表达。因此，我们推测梓醇抑制AGEs诱导的EA.hy926细胞炎症反应，其机制可能与其抑制AGEs诱导的EA.hy926细胞RAGE表达，阻断AGEs-RAGE相互作用，抑制氧化应激反应有关。

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(责任编辑:林白霜，罗森)

Inhibitory effect of catalpol on inflammation and expression of RAGE in EA.hy926 cells induced by advanced glycation end products

LIU Jiang-yue
(Department of Pathophysiology，Weifang Medical College，Weifang 261053，China.E-mail: jiangyue7879@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the inhibitory effect of catalpol on inflammation in EA.hy926 cells induced by advanced glycation end products (AGEs) and to explore its antioxidant mechanisms.METHODS: Human endothelial cell line EA.hy926 was cultured and randomly divided into control group，catalpol (0.5 mmol/L) group，AGEs group，highdose (0.5 mmol/L) catalpol+ AGEs group，middle-dose (0.25 mmol/L) catalpol+ AGEs group and low-dose (0.05 mmol/L) catalpol+ AGEs group.Intracellular reative oxygen species (ROS) production was detected by laser scanning confocal microscopy.The levels of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1)，tumor necrosis factor-α(TNF-α) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in culture supernatant were detected by commercial ELISA kits.The expression of MCP-1，TNF-α，VCAM-1 and receptor for advanced glycation end products (RAGE) in the EA.hy926 cells were detected by Western blot.RESULTS: In high-dose catalpol+ AGEs and middle-dose catalpol+ AGEs groups，the generation of ROS was decreased significantly.The levels of MCP-1，TNF-α and VCAM-1，and protein expression of MCP-1，TNF-α and VCAM-1 were significantly lower.The expression of RAGE protein in EA.hy926 cells were significantly inhibited (P ＜0.05).CONCLUSION: Catalpol effectively inhibits the AGEs-induced oxidative stress and inflammation in EA.hy926 cells，which may be associated with a decrease in the expression of RAGE.

［KEY WORDS］Catalpol; Oxidative stress; Inflammation; Receptor for advanced glycation end products

通讯作者△Tel: 0536-8462020; E-mail: jiangyue7879@126.com

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目(No.8130068) ;山东省自然科学基金资助项目(No.ZR2009CQ013) ;山东省中医药管理局资助项目(No.2013-237)

［收稿日期］2015-02-02［修回日期］2015-03-17

［文章编号］1000-4718(2015)09-1693-06

［中图分类号］R543.1; R363

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.029