白藜芦醇通过调节iNOS抑制C57BL/6J小鼠动脉粥样硬化的机制探讨*

秦　丽，关　莉，林锐珊，薛倩倩，徐进文，闫福曼，李小英，刘海梅△(广州中医药大学基础医学院生理学教研室，西医基础公共实验室，广东广州50006)

白藜芦醇通过调节iNOS抑制C57BL/6J小鼠动脉粥样硬化的机制探讨*

秦丽1，关莉1，林锐珊2，薛倩倩1，徐进文1，闫福曼1，李小英1，刘海梅1△
(广州中医药大学基础医学院1生理学教研室，2西医基础公共实验室，广东广州510006)

［摘要］目的:探讨白藜芦醇(resveratrol，RES)对卵巢切除小鼠血脂四项总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)以及血清一氧化氮(nitric oxide，NO)含量、胸主动脉的过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite anion，ONOO(－))及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)蛋白表达水平的影响。方法:雌性C57小鼠经卵巢切除建立去势模型后，分为假手术组、单纯去势组、假手术高脂组、模型高脂组和RES组。单纯去势组和假手术组给予普通饲料，其余给予高脂饲料。14周后，收集血清检测各组血清的CHOL、TG、LDL-C和HDL-C水平，硝酸还原酶法测血浆NO水平，油红O染色观察动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)情况，DAB染色测定血管ONOO(－)及iNOS水平，免疫印迹测定血管组织的iNOS表达。结果:模型高脂组血清CHOL、TG、LDL-C和NO较正常对照组升高(P＜0.05) ;与模型高脂组相比，RES组可降低小鼠血清的TC、TG、LDL-C和NO(P＜0.05) ; 14周后，AS模型成功建立，模型高脂组有明显的AS病理改变，单纯去势组无明显AS斑块，RES组AS病变明显减轻;高脂喂养14周后，模型高脂组血管组织的iNOS及ONOO(–)表达也较正常对照组明显提高(P＜0.05) ;与模型高脂组相比，RES组可降低小鼠胸主动脉的iNOS表达(P＜0.05)，与此同时，血管ONOO(－)含量较模型高脂组降低。结论: RES可以抑制iNOS表达，减少NO生成，防治动脉粥样硬化。

［关键词］白藜芦醇;动脉粥样硬化;一氧化氮;诱导型一氧化氮合酶

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种炎症性疾病，外源性因素如低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高血压、糖尿病、吸烟等引起的自由基增多，损害内皮，导致内皮功能障碍、单核细胞转化为巨噬细胞、白细胞黏附聚集、淋巴细胞激活等，在局部释放血管活性物质、细胞因子、生长因子和促凝因子等，诱发炎性反应，并刺激诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)蛋白合成增加，一氧化氮(nitric oxide，NO)分泌增多，进一步加重AS。研究发现白藜芦醇(resveratrol，RES)具有潜在的抗AS作用，但其机制尚不明确，本研究用C57BL/6J小鼠建立卵巢切除模型，试图阐明白藜芦醇、iNOS、NO和AS之间的关系。

材料和方法

1实验动物

雌性C57BL/6J小鼠60只，体质量18～22 g，购于广东省实验动物中心，合格证号为No.0004089。

2药物、试剂和主要仪器

RES购自Aladdin; iNOS抗体和nitrotyrosine抗体购自Abcam; GAPDH抗体购自Sigma; SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司; DAB显色试剂盒购自中杉金桥; NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其它试剂均为国产分析纯。

冰冻切片机(Leica) ; Olympus显微镜和ImageJ图像分析软件;冰冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司) ;酶标仪(Bio-Rad)。

3方法

3.1分组和制备去势模型60只雌性小鼠适应性喂养5 d，随机分为6组，即假手术(sham)组、假手术高脂(high fat，HF)组(sham+ HF组)、卵巢切除术(ovariectomy，OVX)组、模型高脂(OVX+ HF)组和RES组。OVX组、OVX+ HF组和RES组均手术去势，摘除双侧卵巢［1］。手术前禁食12 h，以10%的水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰面固定，剔除下腹部长毛，用体积分数75%乙醇消毒手术区域，经下腹部正中开一切口约2 cm，依次切开皮肤，皮下组织，腹白线等，找到子宫，之后沿着子宫末端找到卵巢，结扎后切除卵巢组织，并缝合皮下及皮肤层［2］。其余组进行假手术操作，在切开腹壁后找到输卵管切除部分脂肪后缝合。

3.2分组和给药腹腔术后正常饮食7 d后开始给药。RES组: 10只小鼠，以15 g/L的RES 0.2 mL/d灌胃，高脂饮食; sham组和OVX组:等容积的生理盐水灌胃，普通饮食; OVX+ HF组和sham+ HF组:等容积的生理盐水灌胃，高脂饮食。干预14周。

3.3血清的采集及血脂的测量实验14周末禁食12 h，摘眼球取血约0.5～1 mL，静置后离心分离血清，生化分析仪检测血脂4项总胆固醇CHOL、三酰甘油TG、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇HDL-C。

3.4血浆中NO水平的检测实验14周末，采取眼球取血。将血样本在3 000 r/min离心15 min，用硝酸还原酶法测定NO水平。

3.5胸主动脉油红染色实验14周末取血后小鼠颈椎脱臼法处死，立即取出胸主动脉血管做常规冰冻切片，片厚10 μm，晾干存放在－80℃。用时各组取出1张切片，室温晾干，配置好油红工作液过滤，将配好的油红滴加在组织上10 min，用滤纸吸干周边的油红，将切片放在60%的异丙醇中，待背景变无色后取出(显微镜下观察)，稍微晾干，滴加苏木素溶液(显微镜下见细胞核变蓝色) 3 min，立即将切片置于自来水，流水洗10 min，取出切片甘油明胶封片，显微镜拍片。

3.6免疫组化检测主动脉iNOS的表达胸主动脉经常规固定、脱水、包埋，每例标本均做厚度为10 μm的连续切片6～8张，进行染色。iNOS的蛋白表达测定采用DAB染色，参照试剂盒说明书进行。显微镜观察并拍照，ImageJ进行半定量分析。

3.7各组小鼠胸主动脉ONOO－检测冰冻切片进行DAB染色，使用nitrotyrosine抗体，过程参照试剂盒说明书进行。显微镜观察并拍照，ImageJ进行半定量分析。

3.8Western blot检测iNOS蛋白的表达RIPA法提取组织蛋白，以BCA法进行蛋白定量，用10% SDS-PAGE，转至PVDF膜上。室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h，然后与iNOS和GAPDH相应抗体4℃孵育过夜，次日以TBST洗膜，再用相应的II抗(羊抗兔)室温孵育1 h，洗膜后加化学发光剂暗室中曝光，胶片经显影和定影，蛋白带用凝胶图像分析仪分析和定量。

4统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用S-N-K法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1各组小鼠血脂水平的比较

各组小鼠之间的CHOL、HDL和LDL水平比较差异均无统计学意义; OVX+ HF组除HDL-C较正常组降低外，CHOL、TG和LDL-C均较正常对照组升高(P＜0.05) ;与OVX+ HF组相比，RES预处理后可明显降低小鼠血清的CHOL、TG和LDL-C，升高HDL-C(P＜0.05)，见表1。

表1　各组小鼠血脂水平的比较Table 1.The levels of blood lipids in different groups (mmol/L.Mean±SD.n=6)

2各组小鼠血浆中的NO水平

高脂喂养14周后，OVX+ HF组血清NO含量较sham组明显升高(P＜0.05)，与OVX+ HF组相比，RES可有效降低血清的NO含量(P＜0.05)，见图1。

Figure 1.The effect of resveratrol on plasma NO content in different groups.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.图1白藜芦醇对C57卵巢去势小鼠血浆NO水平的影响

3各组油红染色观察

高脂喂养14周后，sham组血管结构清晰可见，内膜连续完整而光滑; OVX+ HF组的内膜有较明显的脂质斑块，内膜明显增厚; RES组内膜增厚程度均较轻，脂质斑块也明显减少。半定量分析后可见RES组平均光密度值较OVX+ HF组明显降低(P＜0.05)，见图2。结果显示RES对小鼠的AS斑块的形成有抑制作用。

4各组iNOS免疫组化染色观察

高脂喂养14周后，胸主动脉切片进行DAB染色，结果显示OVX+ HF组的iNOS表达相比sham组显著增加，而RES组的iNOS表达量明显低于OVX+ HF组。半定量分析结果显示OVX+ HF组的平均吸光度显著高于其它组，而RES组的平均吸光度则明显降低(P＜0.05)，见图3，说明RES能有效抑制血管内皮iNOS的表达，从而降低NO的生成。

Figure 2.The structure and average absorbance of the aorta in C57BL/6J mice with Oil Red O staining (×20).Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.图2油红染色显示C57BL/6J小鼠胸主动脉结构和油红染色的半定量分析

Figure 3.The effect of resveratrol on expression of iNOS in the thoracic aorta in different groups (×20).Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.图3免疫组织化学染色分析主动脉iNOS的表达

5胸主动脉ONOO－的检测

DAB染色图像显示OVX+ HF组的ONOO－含量显著高于其它组，而RES组的ONOO－含量则较之大幅度减少。半定量分析显示OVX+ HF组组的平均吸光度明显高于其它组，而RES组的平均吸光度只有OVX+ HF组的1/2左右(P＜0.05)，见图4，证明RES能有效地减少ONOO－。

Figure 4.The ONOO－production in the thoracic aorta in different groups (×20).Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.图4血管ONOO－的DAB染色和半定量分析

6各组小鼠血管的iNOS表达

与对照组相比，OVX+ HF组的iNOS蛋白表达明显增高，而RES灌胃后，可明显降低iNOS在血管组织中的表达(P＜0.05)，提示RES能有效抑制iNOS在血管组织中的表达，从而降低NO的合成，见图5。

讨论

AS是一种严重危害人类健康的常见病，是冠心病、脑血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心脑血管病的主要病理基础［3-4］。大量的基础和临床研究表明，AS的危险因素包括高脂血症、高血压、高血糖(糖尿病)、高纤维蛋白原血症，肥胖、肾素-血管紧张素-醛固酮系统活化、吸烟，NO等自体生物活性物质代谢紊乱等因素［5-6］。到目前为止，AS的发病机制尚未完全清楚，存在多种学说，涉及多种危险因素［7］。

Figure 5.The effect of resveratrol on the protein expression of iNOS in the thoracic aorta of different groups.Mean± SD.n=4.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.图5 Western blot检测C57小鼠胸主动脉的iNOS表达

AS发生、发展中，高脂血症所造成的动脉内皮功能损害起关键作用，这种损害可能的原因是内皮细胞NO代谢的异常。NO广泛存在于各种组织和细胞中，是一种重要的生物活性分子。NOS能够催化L-精氨酸生成L-瓜氨酸和NO，现己发现的NOS类型包括神经元型NOS(neuronal NOS，nNOS)、iNOS和内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)。在动脉血管壁组织中与AS相关联的主要是eNOS和iNOS。在正常生理状态下，NO是由内皮细胞产生的eNOS催化产生的，血管中缺乏iNOS。但在某些炎症介质的刺激下，血管中的iNOS可能被诱导表达，产生大量的超出生理浓度的NO，这些过量的NO可能反而引起血管功能障碍，对机体造成损害［8］。因此，NO 在AS的发病中具有双重作用［9］。大量NO与氧自由基可迅速反应生成氧化活性更高的ONOO－，比NO对细胞具有更大的损伤性［10］，从而促进动脉粥样硬化的形成。我们的实验结果显示，与正常对照组相比，模型组有明显的高脂血症，iNOS表达显著升高，产生大量的NO，有明显的斑块形成。

RES是一类目前尚未发现毒副作用的植物雌激素，作用类似于雌激素，但更有优势及其潜力，主要存在于虎杖、藜芦、葡萄等植物中，具有一定的抗AS作用［11］。已有相关研究显示RES可明显降低高脂饮食大鼠血清的LDL、甘油三酯、胆固醇含量，降低动脉硬化指数［12］。边宁等［13］报道高脂对照组大鼠血清iNOS表达显著增加，产生大量NO，给予RES大鼠血清iNOS表达明显减少，血脂显著降低，说明RES可纠正高脂血症大鼠NO代谢紊乱，从而保护血管内皮细胞，对抗AS的发生和发展。也有报道RES具有酚羟基结构，具有很强的自由基清除能力［14］。Olas等［15］研究显示RES可明显抑制高浓度的ONOO－血浆介导的氧化反应，我们的实验结果也表明白藜芦醇组ONOO－生成明显降低，NO含量减少，也证实了这一观点。

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(责任编辑:林白霜，罗森)

Resveratrol regulates iNOS to inhibit atherosclerosis in C57BL/6J mice

QIN Li1，GUAN Li1，LIN Rui-shan2，XUE Qian-qian1，XU Jin-wen1，YAN Fu-man1，LI Xiao-ying1，LIU Hai-mei1
(1Department of Physiology，2Western Medicine Basis Public Laboratory，Basic Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China.E-mail: lhmei99@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of resveratrol on the lipids (CHOL，TG，LDL-C and HDL-C)，nitric oxide (NO)，peroxynitrite anion (ONOO(－)) and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the artery of the mice with ovariotomy (OVX).METHODS: The lipid levels and NO level in the serum were measured.The changes of atherosclerosis were evaluated with Oil Red O staining.The expression of iNOS was measured by DAB staining and Western blot.The ONOO(－)production was measured by DAB staining.RESULTS: Compared with sham group，the levels of the lipids and NO production in OVX+ high fat (HF) group were increased (P＜0.05).Compared with OVX+ HF group，the levels of the lipids and NO production in resveratrol group were decreased (P＜0.05).Fourteen weeks later，the atherosclerosis model was successfully established.Compared with OVX+ HF group，the iNOS expression and the ONOO(－)production in resveratrol group were decreased (P＜0.05)，while those in sham group were increased (P＜0.05).CONCLUSION: Resveratrol prevents and treats atherosclerosis by inhibiting the iNOS expression in C57BL/6J mice.

［KEY WORDS］Resveratrol; Atherosclerosis; Nitric oxide; Inducible nitric oxide synthase

通讯作者△Tel: 020-39358028; E-mail: lhmei99@163.com

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目(No.81202186)

［收稿日期］2015-04-02［修回日期］2015-08-02

［文章编号］1000-4718(2015)09-1601-05

［中图分类号］R363.1; R543

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.012