田七注射液对阿霉素大鼠肾纤维化防治作用研究

胡 溪，吴金玉

(武汉市中医医院,湖北 武汉 430014)



田七注射液对阿霉素大鼠肾纤维化防治作用研究

胡 溪，吴金玉

(武汉市中医医院,湖北 武汉 430014)

目的：探讨田七注射液对阿霉素大鼠肾纤维化的防治作用。方法：运用切除右侧单肾并重复注射阿霉素(ADR)的方法建立肾纤维化大鼠模型，将120只大鼠均分为5组：空白组、假手术组、模型组、对照组、田七组。对照组小鼠予血栓通注射液(20mL/100g/d)腹腔注射给药，田七组小鼠予以田七注射液(2g/kg/d)腹腔注射，正常组和模型组小鼠给予生理盐水灌胃。12周后处死大鼠，观察大鼠的一般情况及肾功能、肾组织等情况，行病理检查及免疫组化测定其ILK、α-SMA的表达。结果：与空白组和假手术组比较，模型组小鼠肾功能、肾小球小管间质损伤程度明显升高，ILK、α-SMA的表达明显上调；与模型组比较，田七组、对照组小鼠肾功能、肾小球及小管损伤程度明显减轻，ILK、α-SMA的表达明显下调。结论：田七注射液可减轻肾功能损害，减轻肾小球和肾小管的损伤，抑制ADR肾纤维化大鼠ILK及α-SMA的表达，延缓肾纤维化发展进程，可能是田七注射液防治肾脏纤维化的作用机制。

田七注射液；肾纤维化；防治作用

肾纤维化发展至终末期主要表现为慢性肾衰竭，也是慢性肾脏病进展至终末期肾病的共同病理特征。研究表明，肾纤维化与祖国医学中“瘀血”的基本病理机制一致，活血化瘀药在一定程度上对肾纤维化有防治作用，三七为常用的活血化瘀药物之一。本课题组选用三七典型中药制剂——田七注射液防治阿霉素致肾纤维化大鼠，观察其对肾纤维化大鼠肾功能、肾组织病理改变的影响，为临床提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD雄性大鼠120只，体重(180±20g)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证：SCXK(湘)2011-0003。在广西中医药大学实验动物学部饲养，普通喂食饮水，每笼5只。饲养1周后建立模型。

1.2 药物

田七注射液由广西中医药大学第一附属医院制剂室生产，规格：100mL，含生药20g。血栓通注射液(主要成分为三七总皂苷，广西梧州制药(集团)股份有限公司，规格：5mL,175mg)。注射用阿霉素(注射用盐酸多柔比星，浙江海正药业股份有限公司，规格：10mg/瓶)。

1.3 动物分组、造模及给药方法

将120只实验大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、对照组、田七组5组，每组24只。用10%水合氯醛(350mg/kg)给予造模大鼠行腹膜下麻醉，将其俯卧固定、取毛、备皮、消毒后，在后背正中往右1cm处开长为1～1.5cm的切口，暴露右肾，剥离肾脏周围包膜，用止血钳夹住肾动脉及输尿管后结扎，摘除右肾，止血，予青霉素0.1mL腹腔注射抗感染，分层缝合、消毒。术后连续3天，肌注青霉素(0.8万U/kg)。术后第7天，拆线，同时尾静脉注射阿霉素5mg/kg，术后第30天重复给予尾静脉注射阿霉素3mg/kg。正常组及假手术组不造模，其余3组均造模。造模后模型组大鼠及假手术组予以生理盐水腹腔注射(10mL/kg/d)；对照组及田七组造模后，分别予腹腔注射血栓通注射液及田七注射液。正常组不予处理。实验期间均予以普通喂食，自由饮水。

1.4 观察及检测指标

一般情况：观察各组大鼠精神状态、毛色、反应能力、体重、饮食情况等；采用全自动生化分析仪检测大鼠肾功能：BUN，SCr；采用免疫组化检测大鼠肾组织ILK、α-SMA蛋白的表达。

1.5 病理学检查

术后87天处死大鼠，留取肾脏组织， 10%甲醛溶液固定、乙醇梯度脱水、透明、浸蜡、包埋后制成3μm的石蜡切片，并进行HE染色和Masson染色。

1.6 肾脏病理检测法

肾组织在高倍镜下随机选取经过染色处理的各组病理切片中30个肾单位进行观察：①肾小球硬化指数(GSI)采用文献中的记载方法[1]，根据切片中的每个肾小球硬化面积进行分级，共分5个等级：0级，即基本正常；1级，硬化面积为1%～25%；2级，硬化面积为26%～50%；3级，硬化面积为51%～75%；4级，硬化面积达到76%～100%。计算肾小球的硬化指数，根据公式GSI(%)=[(1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)/每片肾小球总数]×100%，把1级损害肾小球个数(即N1)、2级损害肾小球个数(即N2)以此类推分别代入公式。随机抽取每张标本切片在光镜(10mm×40mm)下的10个视野进行计算，取其平均值，作为该标本的肾小球硬化指数。②肾小管损伤指数(TII)按Goumenos等[2]法进行半定量分析判断。在400倍光镜下，每张切片随机选10个不含肾小球的视野。肾小管间质病变由蛋白管型和肾小管扩张、间质炎细胞的浸润、间质纤维化的程度等3个参数来判断，并按0～3分评价，即0：肾小管无病理变化；1：轻度受损，视野内损伤小于25%；2：中度受损，视野内损伤25%～50%；3：重度受损，视野内损伤大于50%。肾小管(间质)损伤指数由每个肾脏所有视野的损伤等级加权平均计算而得。每个样本肾小管间质评分为0～9分。

1.7 统计方法

2 实验结果

2.1 各组大鼠一般情况比较

造模前各组大鼠均有活力，反应灵敏，眼球、舌质淡红，毛发顺滑有光泽，食欲佳，粪便正常。造模大鼠(模型组、对照组、田七组)活力明显减退，反应迟钝，眼球暗红，舌质绛紫，尾部出现瘀斑，并有弓背、蜷曲的状况；对照组及田七组大鼠的进食量、活动度、灵敏度略优于模型组(P<0.05)，眼球淡红、舌质绛紫、尾部瘀斑有所改善。

实验过程中由于感染、药物副作用、肾脏出血等原因大鼠出现死亡，最终各组小鼠数目为：正常组及假手术组各24只，模型组22只，对照组及田七组各23只。

2.2 各组大鼠BUN、SCr指标比较

与正常组比较，模型组大鼠BUN、SCr均明显增高，差异有显著统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，田七组和对照组大鼠BUN、SCr均低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)；田七组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。提示田七注射液与血栓通作用相似，均能改善大鼠的肾功能。见表1。

表1 各组大鼠BUN、SCr指标比较 (±s)

注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，*P<0.05；与对照组比较，△P>0.05。

2.3 各组大鼠肾组织病理学指标比较

正常组和假手术组大鼠肾组织结构正常，肾小管、肾小球无病理改变。肾小管间质未见异常改变，亦无纤维化增生。

模型组小鼠肾小球系膜细胞增生，肾小球系膜区呈弥漫性增宽，肾小球数量减少，硬化细胞数量明显增多，肾小球基底膜明显增厚，可见免疫复合物沉积。部分肾小球有新月体形成。肾小管上皮细胞发生坏死、崩解、脱落。肾小管管腔扩张，管腔内可见蛋白管型。肾间质可见大量炎症细胞浸润，肾间质纤维化明显。

田七组和对照组小鼠肾小球系膜细胞轻度增生，肾小球系膜区轻度增宽。球囊粘连较模型组轻，肾小球发生硬化数量较模型组减少。肾小管轻度扩张，管腔内可见少量蛋白管型和细胞脱落碎片，无明显肾小管萎缩。肾间质有少量炎症细胞浸润及轻度纤维化。

2.4 各组大鼠肾小球、肾间质损伤指数的比较

结果显示，田七组、对照组、模型组与正常组、假手术组比较差异均有显著统计学意义(P<0.01)；与模型组相比较，田七组、对照组大鼠肾小球硬化指数及肾间质损伤分数均下降，差异具有显著统计学意义(P<0.01)；与田七组比较，对照组小鼠肾小球硬化指数及肾间质损伤分数均有所升高，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。说明田七注射液和血栓通在一定程度上均可减轻大鼠肾组织病理损害。见表2。

表2 各组大鼠肾小球硬化指数、肾间质损伤分数比较 (±s，%)

注：与模型组比较，*P<0.01。

2.5 各组大鼠肾组织ILK、α-SMA蛋白表达比较

ILK、α-SMA免疫组化的检测结果显示：假手术组与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)；与正常组比较，模型组、对照组、田七组小鼠ILK、α-SMA的表达范围和程度明显上调，差异具有统计学意义(P<0.05)；与对照组、田七组相比较，模型组小鼠ILK、α-SMA表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组与田七组比较差异无统计学意义。见表3。

表3 各组大鼠肾组织ILK、α-SMA表达比较 (±s)

注：与正常组比较，*P<0.05；与对照组比较，△P>0.05。

3 讨论

在肾纤维化中，间质细胞核细胞间质增多，特别是基质蛋白合成增加，使大量细胞外基质(ECM)堆积[3]。肾纤维化与终末期肾病-慢性肾衰竭的进展关系密切，因此对阻止或延缓肾纤维化临床研究越来越多，肾间质纤维化为本实验研究的重点。大量研究发现，TGF-β在肾纤维化中起着关键作用[4]，其中以TGF-β1表达为主，ILK为TGF-β1/Smad信号通路的下游分子，诱导着EMT的生成，ILK会随着肾脏损伤程度而加重，ILK的表达增加会破坏肾小管基底膜，促进小管上皮细胞的迁移和入侵[5]，且α-SMA被认为是肌成纤维母细胞(MFB)的标志蛋白[6]，因此ILK及α-SMA在EMT和肾纤维化中起着关键作用，预防及干预肾纤维化进程。

在祖国医学中，肾纤维化与“肾络癥积”原理一致[7]，病理基础为瘀血阻络。近年来对主要活血化瘀药田七的研究不断深入，特别是田七治疗肾纤维化方向。在一系列的动物实验及临床试验中，研究发现田七注射液可抗肾纤维化和改善肾功能。本实验中，田七注射液治疗后SCr、BUN均有所降低，肾小球发生硬化数量及肾小管间质病变较模型组减轻，ILK、α-SMA的表达明显下调，证实田七注射液对肾纤维化具有预防和治疗作用。

[1] RAIJ L,AZAR S,KEANE W.Mesangial immune injury,hypertension and progressive glomerular damage in Dahl rats[J].Kidney Int,1984,26(2):137-143.

[2] GOUMENOS DS,TSAMANDAS AC,EI NAHAS AM,et al.Apoptosis and myo-fibroblast expression in human glomerular disease:a possible link with transforming growh faetor-β1[J].Nephron,2002,92(2):287-296.

[3] FANG Y,YU X,LIU Y,et a1.miR-29c is down regulated in renal interstitial fibrosis in humans and rats and restored by HIF-alpha activation[J].Am J Physiol Renal Physiol,2013(304):F1274-F1282.

[4] LI JH,ZHU HJ,HUANG XR,et al.Smad7 inhibits fibrotic effect of TGF-β on renal Tubular epithelial cells by blocking Smad2 activation [J].Am Soc Nephrol,2003,14(9):1464-1472.

[5] GRASHOFF C,THIEVESSEN I.Integrin-linked kinase:integrin′s mysterious partner[J].Curr Opin Cell Biol,2004,16(5):565-571.

[6] NG YY,HUANG TP,YANG WC,et a1.Tubular epithelial myofibroblast trans-differentiation in progressive tubulointerstitial fibrosis in 5/6 nephrectomized rats[J].Kidney Int,1998,54(3):864-876.

[7] 王永钧,张敏鸥.痰瘀互结与肾内微型癥积[J].中国中西医结合肾病杂志,2003,4(1):1.

(责任编辑：李岚春)

2015-01-13

胡溪(1987-)，女，武汉市中医医院住院医师，研究方向为中医药防治肾脏病；吴金玉(1965-)，女，武汉市中医医院主任医师，研究方向为中医、中西医结合治疗肾脏病。

R285.5

A

1673-2197(2015)10-0020-03

10.11954/ytctyy.201510009