附子干姜合用二甲双胍对NO抑制型高血压模型小鼠影响观察

张雅倩，陈燕乔，王友群

(中国药科大学 药理研究室，江苏 南京 210009)



附子干姜合用二甲双胍对NO抑制型高血压模型小鼠影响观察

张雅倩，陈燕乔，王友群*

(中国药科大学 药理研究室，江苏 南京 210009)

目的：探讨附子干姜、二甲双胍联合用药对NO抑制型高血压模型小鼠的影响。方法：采用持续两周灌胃给予左旋N-硝基精氨酸(L-NNA)500mg/(kg·d)的方法建立高血压小鼠模型，将其随机分为正常对照组、模型组、附子干姜组、二甲双胍组、附子干姜+二甲双胍组5组，研究附子干姜联合二甲双胍用药对高血压小鼠的降压作用。采用小鼠颈动脉插管手术测量血压，得出平均动脉压(Mean Arterial Pressure, MAP)，采用紫外可见分光光度仪检测小鼠血清、心、肝、肾组织中的NO含量及心、肝、肾组织中的丙二醛含量。结果：模型组小鼠血压明显高于正常组小鼠(P<0.01)，各治疗组小鼠血压均有不同程度的降低，附子干姜、二甲双胍联合用药组(H组)血压接近正常值。H组小鼠血清NO含量及心、肝、肾组织中的NO含量明显减少(P<0.01)，心、肝、肾组织中丙二醛含量显著降低(P<0.01)，差异均具有统计学意义。结论：附子干姜、二甲双胍联合用药对NO抑制型高血压小鼠有一定的治疗效果，可起到降压和保护组织免受氧化损伤的作用，且效果优于单独使用附子干姜组和二甲双胍组。

L-NNA；附子；干姜；二甲双胍；高血压；NO；MDA

高血压是当今世界最常见的慢性疾病之一，体内一氧化氮(Nitric Oxide,NO)合成减少是其发病原因之一。研究显示，使用NO抑制剂后能显著升高大鼠血压，而使用NO促进剂后可有效降低大鼠血压[1]。附子配伍干姜可明显改善冠脉血流量，改善心肌受损情况，明显升高超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量[3]。二甲双胍为临床一线口服降糖药，近年研究表明，其可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，AMPK可能通过内皮一氧化氮(eNOS)这一途径调节内皮细胞功能[4]。本研究通过观察附子干姜与二甲双胍联合用药对NO抑制型高血压小鼠模型的影响，初步探讨其作用机制。

1 材料与试剂

1.1 实验动物

雄性ICR小鼠90只，体重(33±3)g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖厂，动物合格证号SCXK(苏)2007-0001，实验期间给予标准饲料，自由摄食饮水，室内温度控制在25°C左右。

1.2 药品与试剂

左旋N-硝基精氨酸即L-NNA(批号为16011，上海晶纯试剂有限公司)；川附子(批号为20100726，购自南京亿丰大药房，经中国药科大学中药学院王强教授鉴定为川附子)；干姜(批号为20140628，购自南京先声大药房，经中国药科大学药学院生药院鉴定为干姜)；盐酸二甲双胍(批号为20140207，由贵州圣济堂制药有限公司提供)；NO、MDA试剂盒(批号均为20140710)，购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器

752N紫外可见分光光度仪(上海菁华科技仪器有限公司)；RT-6000酶标仪(深圳雷杜)；BS-110-S型电子天平(北京赛多利斯公司)；0412-1型低速离心机(上海医疗器械集团有限公司)。

2 方法

2.1 水煎液制备

按1∶1比例取川附子、干姜适量，加入8倍体积水浸泡30min，武火煮沸后改为文火微沸1h，用脱脂棉过滤，滤渣再加水600mL，以相同方法煮沸、过滤，合并两次滤液，文火微沸浓缩，得到每毫升相当于0.3g附子和0.3g干姜的水煎液。

2.2 动物分组及给药方案

将小鼠随机分为5组：正常对照组(C组，n=10)，模型组(M组，n=20)，附子干姜组(FG组，n=20)，二甲双胍组(Met组，n=20)，附子干姜+二甲双胍组(H组，n=20)。C组小鼠灌胃给予等体积相应溶剂(吐温-80)，M组小鼠灌胃给予L-NNA(500mg/kg)，各给药组小鼠在给予L-NNA的基础上，再分别给予FG(附子水煎剂3g/kg)，二甲双胍组(Met 300mg/kg)，H(附子水煎剂3g/kg+二甲双胍组300mg/kg)。各组小鼠均连续给药14天。

2.3 考察指标

2.3.1 动物一般情况 观察给药期间小鼠的身体状况和活动情况，每天记录体重、摄食量和饮水量。

2.3.2 生化指标 实验周期结束后，将小鼠眼球摘掉，取约1mL血液后立即处死，血样在1 500r/min转速下离心10min，取上清液测定NO、MDA含量。解剖小鼠，取心脏、肝脏、胃、左侧肾脏部分组织，在冰浴条件下按质量体积比1∶9加入生理盐水，制成10%的组织匀浆，在2 000r/min转速下离心10min，取上清液，测定其中NO、MDA含量。组织蛋白含量采用考马斯亮兰法测定。

2.3.3 血压 用药2周后，采用20%乌拉坦麻醉各组小鼠，使用BL-410生物机能实验系统，采用小鼠颈动脉插管手术测定血压，记录平稳后的血压变化，计算出平均动脉压(MAP)。

2.4 统计学分析

采用SPSS11.5软件对本实验数据进行统计分析，剂量数据采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 动物一般情况

与正常对照C组比较，接受L-NNA灌胃给药的各组小鼠体重均下降，摄食量也相对减少。但在给药后3天，各给药组小鼠体重均有不同程度的回升趋势(见图1)。模型组小鼠喜卧好静，状态萎靡，被毛发黄干枯不齐，部分小鼠死亡；与模型组相比，FG组和Met组小鼠状态均有明显改善。

图1 实验期间各组小鼠体重变化

3.2 各组小鼠血压变化

与正常对照组比较，模型组小鼠血压升高极其明显，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，各治疗组小鼠血压均有所下降，差异具有统计学意义(P<0.01)，其中附子干姜合用二甲双胍组小鼠血压值几乎接近于正常对照组，治疗效果最明显，表明两药合用具有协同作用(见表1)。

注：与对照组比较，**P<0.01 ；与模型组比较，&&P<0.01。

3.3 附子干姜、二甲双胍及两药合用对小鼠组织MDA含量影响

与正常对照组相比，模型组小鼠各组织MDA含量均显著升高(P<0.01)。从表2可以看出，心脏氧化损伤最为严重，其次为肾和肝。与模型组小鼠相比，附子干姜和二甲双胍组小鼠心脏组织MDA含量明显下降(P<0.05)，且两药合用组小鼠下降更为显著(P<0.01)；与模型组比较，附子干姜组小鼠肝脏组织MDA含量显著下降(P<0.05)，而二甲双胍组小鼠下降不明显，但两药合用组小鼠下降极为显著(P<0.01)；与模型组比较，附子干姜组小鼠肾脏组织MDA含量显著下降(P<0.05)，而二甲双胍组小鼠下降不明显，但两药合用组小鼠显著下降(P<0.01)(见表2)。

组别心肝肾C2.31±0.37**0.37±0.12**0.93±0.17**M3.25±0.62&&0.67±0.19&&1.52±0.40&&FG2.50±0.55*0.50±0.14*0.99±0.22*Met2.59±0.93*0.51±0.161.27±0.57H2.37±0.52**0.44±0.16**0.96±0.28**

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，&&P<0.01。

3.4 附子干姜、二甲双胍及两药合用对小鼠组织和血清NO含量影响

与正常对照组相比，模型组小鼠各组织NO含量显著低于对照组(P<0.01)。从表3可以看出，血清所含NO最多，其次为肾、心、肝。与模型组相比，二甲双胍组小鼠心脏组织NO含量显著升高(P<0.05)，而附子干姜组小鼠升高不明显，两药合用组小鼠升高极其显著(P<0.01)；与模型组比较，二甲双胍组小鼠肝脏组织NO含量显著升高(P<0.05)，而附子干姜组小鼠升高不明显，两药合用组升高极其显著(P<0.01)；与模型组比较，附子干姜和二甲双胍组小鼠肾脏组织NO含量显著升高(P<0.05)，且两药合用组小鼠升高极其显著(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组小鼠血清NO含量升高均具有极显著差异(P<0.01)(见表3)。

组别心肝肾血清C1.74±0.20**0.98±0.29**2.15±0.49**62.26±16.43**M1.11±0.26&&0.52±0.32&&1.19±0.49&&33.78±8.97&&FG1.47±0.510.77±0.201.75±0.42*55.48±9.57**Met1.50±0.37*0.80±0.25*1.68±0.75*61.26±13.97**H1.78±0.35**0.88±0.24**2.02±0.49**67.25±18.67**

注：与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，&&P<0.01。

4 讨论

心血管疾病的危险因素，如高血压、糖尿病、血脂异常、肥胖等均与内皮性一氧化氮合酶功能受损有关，也就是说NO生成减少是导致上述疾病的重要原因[5]。有文献研究指出，一氧化氮合酶抑制剂通过减少融合、增加分裂增殖等作用显著改变线粒体内机能蛋白的表达谱，同时减弱了主动脉线粒体对外来干预的适应性。在脉管系统中，内皮型一氧化氮合酶在基底和自适应线粒体生物合成和监管线粒体转换中发挥着重要作用[6]。由此可知，L-NNA造模后对小鼠体内线粒体功能均有一定程度的抑制作用。二甲双胍为常用抗糖尿病药物，近年研究发现，二甲双胍可通过AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)增加eNOS的磷酸化及其表达，增加血浆NO水平并降低全身血管阻力，起到改善内皮功能和降低血压的作用[7]。研究认为，二甲双胍通过减少活性氧簇产物来影响线粒体的氧化应激性[8]。本实验研究结束时，模型组小鼠各组织和血清中NO含量水平均低于正常组约2倍，FG组、Met组、H组小鼠各组织和血清中NO含量均有显著性提高，其中H组小鼠NO含量高于正常组，说明二甲双胍可改善内皮一氧化氮合酶功能，增加体内一氧化氮含量。本实验室前期研究认为附子干姜通过亚硝酸盐途径提高NO含量，因此两药合用可通过多途径产生协同降压效果。

本研究采用颈动脉插管测定小鼠血压，结果表明，模型组小鼠血压显著升高，附子干姜组和二甲双胍组小鼠血压均有所下降，与文献中提到的二甲双胍能增加血清中NO含量相吻合。同时，H组小鼠血压接近正常血压值，提示两药合用疗效增强。本实验研究表明，模型组小鼠各组织MDA含量均升高，其中心脏组织MDA含量最高；各治疗组小鼠MDA均有所下降，提示FG组和Met组小鼠组织损伤都受到了相应药物保护。H组小鼠各组织MDA含量均显著下降，进一步验证了两药合用具有协同降压效果。

综上所述，附子干姜和二甲双胍通过双重途径提高内皮型一氧化氮合酶活性，升高体内一氧化氮含量，减轻组织氧化损伤，对L-NNA所致高血压小鼠的整体机能具有明显改善作用，但其具体机制及更深层次的分子水平研究有待进一步探索。

[1] 郭国庆,沈伟哉.Nω-硝基-L-精氨酸和谷氨酸单氨钠对高血压大鼠心率、血压及脑卒中的影响[J].暨南大学学报:自然科学与医学版,2002,23(6):10-15.

[2] CHANG H R, LEE R P, WU C Y, et al. Nitric oxide in mesenteric vascular reactivity: a comparison between rats with normotension and hypertension[J].Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,2002,29(4):275-280.

[3] 黄颖,武乾,石晓路,等.附子、干姜配伍机制现代研究概述[J].中华中医药学刊,2013,31(9):1884-1886.

[4] CHEN ZP,MITCHEHILL KI,MICHELL BJ,et al.AMP-activated protein kinase phosphorrylation of endothelial NO synthase[J].FEBS Letters,1999,443(3):285-289.

[5] MILLER MW, KNAUB LA, OLIVERA FRAGOSO LF, et al. Nitric oxide regulates vascular adaptive mitochondrial dynamics[J].American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology,2013,304(12):H1624-H1633.

[6] COOPER CE, GIULIVI C. Nitric oxide regulation of mitochondrial oxygen consumption II: molecular mechanism and tissue physiology[J].American Journal of Physiology-Cell Physiology,2007,292(6):C1993-C2003.

[7] MATHER KJ,VERMA S,ANDERSON TJ. Improved endothelial function with metformin in type 2 diabetes mellitus[J].Journal of the American College of Cardiology,2001,37(5): 1344-1350.

[8] HOU X,SONG J,LI XN,et al. Metformin reduces intracellular reactive oxygen species levels by upregulating expression of the antioxidant thioredoxin via the AMPK-FOXO3 pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2010,396(2):199-205.

(责任编辑：尹晨茹)

The Effects and Interactions ofRadixAconitiLateralis Preparata Combined with Rhizome Zingiberis and Metformin on NOS Inhibitied Mice

Zhang Yaqian, Chen Yanqiao, Wang Youqun*

(Department of Pharmacology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

Objective:To observe the therapeutic effects ofRadixAconitiLateralis Preparata combined with Rhizoma Zingiberis or metformin alone and their combination on NOS inhibition induced hypertensive mice.Methods:The Nitric oxide synthase (NOS) inhibition-induced hypertension model was established by intragastric administration with L-NNA(500mg/kg)for two weeks. To study the combination antihypertensive effect of high blood pressure in mice; Use the mice carotid artery surgery to obtain mean arterial pressure (MAP); Use UV-visible spectrophotometer to detect content of NO in serum and measure NO and malonaldehyde (MDA)in the heart, livers, kidneys homogenated. Results:Compared with control group, the blood pressure of model group were increased significantly(P<0.01). Compared with model group, the treatment groups have different degree to reduce blood pressure. The blood pressure of combination group(H group) were close to control group. The contents of NO in serum, heart, liver and kidney of H group sharply increased(P<0.01), and MDA decreased(P<0.01). Conclusion:The combination group posed significant effect on the blood pressure, the contents of NO and MDA to protect the tissues from oxidative impairment, among which the mice in FG+B+L group were closer to normal level. And the effect is better than that of single use of FG group and metformin group.

L-NNA;RadixAconitiLateralis Preparata;Rhizoma Zingiberis;Metformin; Hypertension; NO; MDA

2014-09-04

张雅倩(1989-)，女，中国药科大学硕士研究生，研究方向为心血管药理。

王友群(1956-)，男，中国药科大学副教授，研究方向为心血管药理。

R285.5

A

1673-2197(2015)02-0008-03

10.11954/ytctyy.201502004