中药川贝母质量控制方法研究

刘 薇，张文娟，程显隆，魏 锋，马双成

(中国食品药品检定研究院 中药民族药检定所，北京 100050)



中药川贝母质量控制方法研究

刘 薇，张文娟，程显隆，魏 锋*，马双成*

(中国食品药品检定研究院 中药民族药检定所，北京 100050)

从川贝母化学成分定量、药理活性和质量分析方法等方面对川贝母进行了系统的文献整理和介绍，为其进一步的开发利用提供有益参考。依据相关文献，总结川贝母中主要成分、生物活性及其分离分析方法进展。现代研究表明，川贝母中主要活性成分为生物碱类化合物,而且药理作用广泛；此外，针对上述活性成分出现较为高效、快速的分离分析方法。为严格控制川贝母质量稳定，保证临床疗效和用药安全，推进川贝母资源开发提供了有益的研究基础。

川贝母；现代研究；质量控制

川贝母来源于百合科(Liliaceae)贝母属(Fritillaria)多种植物的干燥鳞茎。《中国药典》2010版收载的川贝母(FritillariaeCirrhosaeBulbus)来源于植物川贝母(FritillariacirrhosaD. Don)、暗紫贝母(FritillariaunibracteataHsiao et K. C. Hsia)、甘肃贝母(FritillariaprzewalskiiMaxim.)、梭砂贝母(FritillardelavayiFranch.)、太白贝母(FritillariataipaiensisP. Y. Li)或瓦布贝母(FritillariaunibracteataHsiao et K. C. Hsia var. wabuensis (S. Y. Tang et S.C. Yue) Z. D. Liu, S. Wang et S. C. chen.)，主治肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳嗽、痰中带血等症，具有“止咳圣药”之称。

贝母药用历史非常悠久，始载于《神农本草经》，列为中品，气味辛、平。在长期的药用历史中，根据药材外观、药效和药性等差异形成了不同的贝母类药材。由于川贝母与其它贝母类药材的价格差异较大，市场上经常出现川贝母药材和饮片掺杂、掺伪、掺假等现象。由于贝母类药材外观形态有很多相似之处，难于区分，致使川贝母的品质控制具有较大难度。长期以来，由于川贝母用药量不断增大和药材生长周期长等因素的限制，其野生资源正在持续减少，其中主要基原植物川贝母已被列入国家三级保护植物名单。

1 川贝母的现代研究概况

1.1 川贝母的资源学研究

百合科(Liliaceae)贝母属(Fritillaria)是药用贝母的主要来源，全属分为5组。包括多种有价值的药用植物，大部分鳞茎可供药用。该属约有130种，广泛分布于北半球的温带地区。近年来，我国学者发现了众多新种和变种，使国产贝母属植物的“种”达到80个，“变种”名达52个，变型名6个[1]，主要分布于四川、新疆、甘肃、湖北、安徽、浙江等地。按道地产区可分为川贝母、浙贝母、平贝母、湖北贝母、伊贝母及安徽贝母。贝母组植物在我国分布广泛，除广东、广西、福建、海南等地外，其余各省均有一至数种。目前已有11种被2010版《中国药典》收载。其中以川贝最为著名，已用于多种复方中成药中，如川贝枇杷膏液等[2]。主要分布于川西高原，川西北高原和横断山脉北翼。主要生长于海拔2 800～4 700m的高山灌丛或草地，地势高亢，气候干冷。该区所产川贝母颗粒均匀、质坚实、粉性足、色白有光泽，质量谓为上乘。其中集散于四川松潘等县附近故名“松贝”；青贝主要产于四川青川附近故名“青贝”，炉贝主要产于四川甘孜州，来源植物为梭砂贝母[3-4]。另外，罗毅波等[8]将川贝母及其近缘种归为4个种群，包括川贝母、太白贝母、榆中贝母(Eyuzhongensis)、华西贝母(Esichuanica)，认为这4个种形成的川贝母复合群在形态上没有明显界限，其鳞茎均为商品川贝中“青贝”的主要来源。按照外观性状不同，分别习称“松贝”“青贝”“炉贝”和“栽培品”。传统上贝母商品按照鳞茎大小来分，以较小者为上。由于未开花的川贝母无论从外观性状抑或鳞茎形态都很难区分，因此市场上的商品川贝母常有混售的现象。

目前，商品川贝母以野生资源为主，主要分布于四川西北部及青海、甘肃、西藏等交界处。该区跨越了青藏高原、横断山脉、云贵高原等几大地貌单元，地理环境复杂，气候类型独特，是中药川贝母的主要产区。近些年来，由于需求不断扩大，采挖不合理加之贝母本身对生长条件要求苛刻，生长周期长等因素，野生资源已经濒临枯竭。学者们正尝试以各种方式扩大川贝母的资源来补充市场的不足。陈士林等[5-6]在青藏高原山地实施川贝母的野生抚育，结合川贝母的自然条件优势，基本实现了川贝母的人工种植。

李萍和徐国钧[7]对18种贝母的生物碱进行HPLC定性分析，结果表明太白贝母与川贝母(暗紫贝母、甘肃贝母)所含生物碱种类无差异。而太白贝母作为川贝母的一个新资源被2010版《中国药典》收载于川贝母项下，对川贝母市场份额是一个极大补充。

1.2 川贝母化学成分研究

贝母化学研究工作最早开始于1888年，Frganer首先从德旺贝母(EimperialL．)中分离得到蒂贝灵(imperialine)[9]，后被证实即为西贝素。1955年朱子清教授领导其研究小组将锌粉蒸馏和硒脱氢两种方法联合并用确定了贝母生物碱的骨架，至今己从贝母属中分离鉴定的化合物近200个[10]，川贝母属于贝母属的一个类群，主要包括生物碱类(生物碱及其苷)和非生物碱类。

1.2.1 生物碱类成分 生物碱是川贝母的特征性成分，也是主要活性成分。按结构类型分，其甾体生物碱可分为两大类：异甾体类(isosteroidal alkaloids)和甾体类(steroidal alkaloids)。根据五元或六元环的结构不同，异甾体生物碱又可分成瑟文型(cevanine group)、介藜芦型(jervine group)和藜芦胺型(veratramine group)，甾体类生物碱又分为茄碱型(solanidine group)和裂环茄碱型(secosolanidine group)(图1)。从川贝母植物中分离出的生物碱绝大多数属于异甾体生物碱，见图1、图2。

图1 川贝母中甾体生物碱的基本骨架

1.2.2 非生物碱类成分 余世春等[24]在研究暗紫贝母化学成分过程中分离得到硬脂酸与软脂酸的混合物。严忠红等[23]对卷叶贝母的化学成分进行研究，从中分离得到2个非生物碱类化合物，即腺苷和胸苷。陈阳[25]对川贝母非生物碱类成分进行研究，分离得到9个化合物，其中6个分别为谷甾醇、油酸、对羟基桂皮酸、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、蔗糖及谷甾醇葡萄糖苷，其它3个可能为木质素类化合物、油酸类化合物和多元醇。2008年，曹新伟等[l9]从川贝母和梭砂贝母中分别分离得到12和17个非生物碱化合物，其中9个首次从川贝母中分离到，包括肉桂酸、单棕榈酸甘油酯、胡萝卜苷、尿嘧啶、胸嘧啶、尿苷、胞苷、肌苷和鸟苷。从梭砂贝母中分离到的17个非生物碱类化合物均属首次，包括有机酸类(E-3，4，5-三甲氧基肉桂酸、E-对甲氧基肉桂酸、E-肉桂酸、E-对羟基肉桂酸、阿魏酸及咖啡酸等)、核苷(尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷)、嘧啶(尿嘧啶、胸嘧啶)、胡萝卜苷等。另外，吴荣熙等[23]从浙贝母(F.Thunbergii)鳞茎中首次分离得到一种羟基化合物。迄今已经从贝母属植物中分离到40多种非生物碱化合物，主要包括萜类、甾体、脂肪酸、核苷、嘌呤、嘧啶等化合物。

图2 川贝母中的瑟文型生物碱骨架

在贝母近百年的研究历史里，生物碱一直受到很大的关注，非生物碱部分的报道相对较少。从贝母属植物化学研究发展来看，该类化合物也应会成为今后探索的一个方向。

1.3 药理活性研究

传统医学认为，川贝母具有清热润肺，化痰止咳，散结消痈之功效具有“止咳圣药”之称。现代药理研究表明其具有很多药理作用。

1.3.1 镇咳祛痰作用 李萍等[26]对暗紫贝母、梭砂贝母等11种商品贝母进行了小鼠氨水引咳实验和酚红祛痰实验，发现11种贝母的总生物碱部分起到了良好的镇咳效果，但是皂苷部分具有明显的祛痰作用。结果证明在贝母中能起到祛痰作用的是总皂苷部分。除梭砂贝母和伊贝母外，其余9种贝母的乙醇提取物亦有显著的镇咳作用，除浙贝母、紫花鄂北贝母及鄂北贝母外，另外8种贝母醇提物均有祛痰作用，但总体来说还是总皂苷部分的作用效果最明显。汪丽燕等[27]将川贝、浙贝及皖贝3种贝母在同一条件下进行贝母的镇咳祛痰机制研究，结果表明皖贝对电刺激神经干和尼可刹米的呼吸兴奋作用都没有明显影响，所以可以认为贝母只对咳嗽中枢具有抑制作用，而对呼吸中枢没有影响。比较3种贝母的药理作用，发现川贝和皖贝都具有良好镇咳作用，而浙贝的效果低于二者。切断大鼠的迷走神经后，利用毛细管排痰观察大鼠的排痰量，结果显示用药后大鼠的排痰量增加，由此可以说明贝母属于非恶心性祛痰药。比较该3种贝母的祛痰效果，发现三者的祛痰作用都比较明显，但是浙贝的作用最强，其次是皖贝，最后是川贝。沈力等[28]通过氨水引咳法及酚红祛痰法对太白贝母及暗紫贝母的镇咳祛痰作用进行比较研究，发现两者的镇咳作用无显著差异，但太白贝母减少咳嗽次数较优。相同剂量下，太白贝母的祛痰作用要明显优于暗紫贝母。颜晓燕等[29]采用小鼠氨水引咳及豚鼠枸橼酸引咳法比较暗紫贝母、栽培瓦布贝母及浙贝母的镇咳作用，用小鼠酚红排痰法及大鼠毛细管排痰实验法比较3种贝母的祛痰作用，结果发现栽培的瓦布贝母的镇咳作用与其它2种贝母作用相当，而栽培瓦布贝母的祛痰效果也与暗紫贝母无显著差异，栽培瓦布贝母或许可以作为川贝母的一个代用资源进行推广。

1.3.2 平喘作用 川贝、平贝等[30]都具有明显的平喘功效。莫正纪等[31]对3种来源不同的川贝母醇提取物的药理作用进行比较，发现注射此提取物后小鼠的耐缺氧能力明显增强，而且对小鼠离体肺、支气管还起到了一定的扩张作用。栽培瓦布贝母可明显升高小鼠肺脏cAMP水平，对平喘起到了良好的作用。周颖等[32]对贝母甲素、贝母乙素、西贝素、西贝素苷和蒲贝酮碱5种甾体生物碱对卡巴胆碱引起的豚鼠离体气管收缩进行有效的抑制，说明贝母之所以起到平喘作用可能是因为对气管壁M受体产生作用既而使气管得到舒张。赵益等[33]对贝母辛的平喘机制进行了初步探讨，发现贝母辛通过作用于M受体、兴奋β受体和拮抗内钙释放，使得体内生成NO并释放，从而促进了气管平滑肌舒张，从而起到了平喘作用。

1.3.3 对心血管系统的作用 有研究报道西贝素[34]对麻醉狗有降压作用，主要是由外周血管扩张，对心电图无影响。对离体豚鼠回肠、兔十二指肠、大鼠子宫及整体狗小肠有明显松弛作用，且随浓度增加而增加，并能对抗乙酸胆碱、组胺和氯化钡的平滑肌痉挛作用，其解痉作用类似婴粟碱。陈泽乃等[35]根据4种贝母抑制由血小板活化因子(Pay)诱导血小板聚集的有效部位筛选结果，从平贝母的水溶性活性部位中分得胸苷和腺苷等成分。实验证明腺苷为抑制血小板聚集的主要成分。这可能是由于PAF具有Ca2+载体的作用，能刺激和引起Ca2+流的产生，而腺苷通过兴奋腺苷环化酶刺激形成，从而起到抑制聚集的作用。提示核苷类可能是贝母中除生物碱外的另一类活性成分。贝母的水提取物能保证大鼠血管组织中NO的生成和血浆中NO代谢产物的浓度， 不改变NOS蛋白的表达， 而使大鼠收缩期高血压恢复正常。同时， 还能明显改善大鼠的肾功能参数， 包括排尿量、排钠量、肌酐清除率的变化，提示其降压作用可能部分是由增加血管组织中NO的生成和改善肾功能而产生的[36]。

1.3.4 其它药理作用 章鸣玉等[37]研究贝母对小鼠耐受常压缺氧的作用，结果显示湖贝、川贝、鄂贝醇提物都可以使小鼠耐受常压缺氧的能力明显提高，使组织对氧的需求降低，有利于降低哮喘患者的发病概率。熊玮等[38]曾在1984年研究了川贝母醇提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的作用，发现抑制作用明显。

1.3.5 毒性研究 在急性毒性实验中，研究了栽培的瓦布贝母、浓蜜贝母与野生川松贝母3种贝母的口服毒性，发现小鼠灌胃给药的最大耐受量(MTD)均大于60g·kg-1(生药量)，是临床用量的480倍，说明这些川贝的口服毒性都比较低[39]。

1.4 川贝母药材的质量控制和评价

我国贝母属植物种类繁多、分布广泛。不同贝母类植物在形态上有很大的相似性，区分比较困难。同一种贝母植物在不同的生长条件下，往往形态学变化又很大，很难鉴别。这种现象的存在，给中药贝母的质量控制、生产流通及临床应用等增加了困难。因此，一直以来，许多学者一直致力于贝母质量评价标准的研究，以期寻找到合适的评价方法来控制贝母的质量，从而保证临床用药安全。

1.4.1 总生物碱的含量测定 生物碱作为公认的有效成分之一，一直被用作贝母品质评价的内在标准。一些专家学者们先后尝试用各种方法对其总生物碱和单体生物碱进行定性和定量分析。以总生物碱的含量作为评价标准是最先被应用到贝母质量控制上的，相应的滴定法、比色法等相继运用到川贝总生物碱的含量测定中。常用的滴定法主要有两相滴定法、酸碱滴定法和非水滴定法。马利琼等[40]采用两相滴定法分别对川贝母的4个基原种川贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母的总生物碱进行定量分析，得到4个川贝母基原植物的总生物碱含量分别为0.08%、暗紫贝母为0.04%、梭砂贝母为0.07%、甘肃贝母为0.05%。王曙等[41]应用两相滴定法和重量法对川贝母及其它贝母类药材的总生物碱和总皂苷分别进行了比较研究，发现川贝母的总生物碱含量在0.05%～0.1%，而浙贝母、伊贝母和平贝母的总生物碱含量在0.1‰～0.2%，川贝母的总皂苷含量在2.0%～4.0%，而其它贝母药材的总皂苷含量在1.0%～2.0%。可见两相滴定法所需设备比较简单，在贝母总生物碱的含量测定上具有很大的优势，但此种方法受水相pH值的影响较大，而且难以掌握滴定终点。酸碱滴定法的原理是酸碱中和对生物碱进行直接定量测定。黄梦娴[42]利用酸碱滴定法对三蛇胆川贝糖浆中总生物碱的含量进行了测定。但是共存干扰物质对这种方法影响较大，而且对于碱性较弱的生物碱不能用此法进行测定。非水滴定法在贝母总生物碱测定中亦有一定的应用，该法是以非水溶剂作为滴定递质，以达到滴定弱碱性生物碱的目的。李萍等[43]以冰醋酸溶液作为滴定递质，测定了21种贝母的总生物碱含量，认为该法对含生物碱苷贝母类药材和制剂具有很好的效果。分光光度法是目前测定贝母类总生物碱最为常用的方法。刘辉等[44]采用酸性染料比色法对不同采收时期的川贝母总生物碱含量进行测定，确定了川贝母的最佳采收时期为6-7月。

1.4.2 单一生物碱的含量测定 现代分析技术特别是色谱技术的发展，为单一生物碱的研究提供了技术保证。各种色谱技术不断被应用到单一生物碱的定性和定量分析，如薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱和毛细管电泳色谱等技术。薄层扫描法(TLC)的扫描对象是薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点，药品质量检查的依据就是扫描得到的图谱及积分值。薄层扫描法由于操作简单、重复性好，常被用于中药材的定性分析。张兰珍等[45]应用薄层扫描法对蛇胆川贝液中贝母甲素、贝母乙素进行了很好的检识。梁海慧[45]应用该法测定蜜炼川贝枇杷膏中贝母素乙的含量。蓝日盛等[47]利用该法对不同采收期及加工方法的川贝中的西贝素进行了含量测定。李松林等[48]采用柱前衍生化气相色谱法对国产16种药用贝母中的异甾体生物碱进行研究，根据所测生物碱在16种贝母中存在与否及生物碱类型进行区分。2000年，Li等以氮气作为载气，直接采用气相色谱法对7种贝母异甾体生物碱进行定量分析，结果表明不需要柱前衍生化而直接通过气象色谱进行分析也可达到较好的效果，同时可以节省时间，重现性和精密度均很好。高效液相色谱法是目前应用最广泛的一种分析技术，它具有分析对象广泛、分离度高、重复性好等优点。常用的检测器主要有紫外检测器，然而紫外检测器只适用于具有生色基团物质的检测，而对于不含或少有共轭结构的生物碱单体检测难度较大。蒸发光散射检测器的发展，解决了大多数贝母生物碱因无紫外吸收无法直接用HPLC定量分析这一难题，众多学者采用此法对贝母中单体生物碱成分进行了研究。刘震东等[49]利用高效液相-蒸发光散射法(HPLC-ELSD)测定了栽培的瓦布贝母西贝素的含量。朱丹妮等[50]利用HPLC-ELSD分析测定5种贝母类药材中贝母甲素的含量。刘晶等[51]应用HPLC-ELSD分析测定了川贝母新的基原植物太白贝母和瓦布贝母鳞茎中贝母辛的含量，结果显示两种贝母中的贝母辛含量均高于其它基原植物样品。

1.4.3 非生物碱类成分的含量测定 贝母中非生物碱成分主要为核苷类成分，近年来对贝母中核苷类成分的研究越来越多。腺苷作为一种天然成分，已知具有抗凝血、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌、镇静中枢神经、抗心率不齐和消炎等作用，近年来备受人们的关注。徐汝明等[52]用不同的方法先后对几种不同的贝母中腺苷的含量进行分析，结果表明贝母生药的抗凝血作用可能与其含有的核苷类成分有关。Duan等[54]用HPLC及HPLC-MS对川贝母中的核苷类成分做了系统的研究，发现了10个核苷成分，并对其进行了定性定量分析。

1.4.4 指纹图谱研究 中药指纹图谱与以往靠单一有效成分评价中药材的质量方法有所不同，它是一种综合的鉴定手段。它以中药化学成分系统研究为前提，通过样品谱图之间的差异从整体上对中药材以及中药制剂半成品进行比较评价，“整体性”和“模糊性”为其显著特点。与传统的方法相比，指纹图谱综合考虑了谱图之间的相似与差异，在评价中药质量的稳定性和一致性上具有其独特的优越性。王聪等[55]对8种植物来源的贝母(川贝母、太白贝母、暗紫贝母、梭砂贝母、瓦布贝母、浙贝母、伊贝母和平贝母)的HPLC-ELSD指纹图谱进行分析，发现川贝母类及与其他贝母类指纹特征的区别。沈力等[56]建立了不同商品规格太白贝母与暗紫贝母中皂菅类成分的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，标定出21个共有峰，相似度在95%以上。李斌等[57]建立了5种贝母的弱极性成分HPLC指纹图谱，标定了16个共有指纹峰及各自的特有峰。指纹图谱的发展为综合评价贝母的质量提供了一个新的思路。

2 结语

我国贝母属植物资源丰富，古典药典收载了多种贝母品种，除此之外，在民间贝母属的多种药用植物也得到了广泛应用。该属药用植物主要含有异甾体和甾体生物碱类成分。现阶段，国内外学者主要致力于研究总生物碱的药理，主要包括其对止咳、祛痰、平喘和对平滑肌影响等方面的药理活性。相关学者认为贝母类药材的主要活性成分为总生物碱，但对某单一生物碱成分药理作用并没有进行深入研究。进一步的研究发现，在治疗心血管系统、中枢神经系统疾病和抗肿瘤等方面贝母类药材也显示了较好的药理活性。此外，相关专家逐渐转向对贝母类药材中非生物碱类成分如核苷类和酚酸类的研究，特别是对核苷类成分的分离、含量测定及药理活性展开了深入的研究，结果发现有可能是贝母类药材除生物碱外的活性成分。

川贝母具备有好的临床效果，具备多种药理活性，但是对于川贝母具体的化学成分的研究还不够。因为在临床上把多种贝母属植物都作为川贝母使用，使得市场出现了很多赝品，难以控制川贝母的质量。所以，系统研究川贝母的主要基源种的化学成分，并对其有效成分及各生物碱的药理活性进行分析，对川贝母的质量进行合理规范评价，将有利于川贝母临床用药的安全性，有利于有效地控制其质量，有利于对贝母属植物资源进行合理开发和利用。

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(责任编辑：宋勇刚)

Progress in Bioactive Constituents and Isolation and Analysis Methods ofFritillariaeCirrhosaeBulbus

Liu Wei, Zhang Wenjuan, Cheng Xianlong, Wei Feng*, Ma Shuangcheng*

(Institute for Control of Chinese Traditional Medicine and Ethnic Medicine ,National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC)，Beijing 100050，China)

To summarize the bioactive constituents inFritillariaeCirrhosaeBulbus and its latest isolation and analysis methods and to come to a better understanding on the species and lprocide beneficial support for its further development. Based on the related literatures, the main constituets and their bioactivities and their isolation and analysis methods were summarized. Previous pharmacological investigations indicated that isosteroidal alkaloids were responsible for the therapeutic effects and other various bioactivities. Additionally，there were some new iso1ation and analysis methods for the above bioactive constituents．In order to control quality ofFritillariaecirrhosaebulbus were analyzed in some aspect. Therefore, establishing exclusive method of quality control will have a profound influence on the reasonable application and development.

FritillariaeCirrhosaeBulbus；Modern Research; Quality Control

2014-10-15

国家科技重大专项“中药安全检测技术及标准平台”项目(2014ZX09304307-002)

刘薇(1978-),女，博士，中国食品药品检定研究院中药民族药检定所助理研究员，研究方向为中药质量控制。

R284

A

1673-2197(2015)02-0041-06

马双成(1966-)，男,博士，中国食品药品检定研究院中药民族药检定所研究员，研究方向为中药民族药质量控制及评价; 魏锋(1971-)，男，博士，中国食品药品检定研究院中药民族药检定所研究员，研究方向为中药质量控制。