糙米培养虫草菌丝体技术及其有效成分含量测定

莫炫永,陈涌涛

(1.东莞市国药质量检测中心，广东 东莞 523010；2.湖北省科技信息研究院，湖北 武汉 430071)



糙米培养虫草菌丝体技术及其有效成分含量测定

莫炫永1,陈涌涛2*

(1.东莞市国药质量检测中心，广东 东莞 523010；2.湖北省科技信息研究院，湖北 武汉 430071)

冬虫夏草是一种非常名贵的中药材，主产于我国青藏高原，有神山圣草和中药之王的美誉，在传统医药中占据重要地位。但近几年，由于过度采挖和生态环境的恶化，野生资源几近枯竭，而虫草的人工养殖却一直没有取得突破，因此寻找其替代品十分重要。探讨糙米培养虫草菌丝体技术并对人工培养的虫草菌丝体的有效成分进行了含量测定。

冬虫夏草；替代品；虫草菌丝体；人工培养；有效成分；含量测定

冬虫夏草[Cordycepssinensis(Berk.)Sacc]为我国名贵的传统滋补强身中药材，现代药理学研究表明,其含有多种生物活性物质，具有扩张血管、降血压、镇静、抗菌、抗肿瘤、调节免疫、抗氧化、抗衰劳等多种药理作用。冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在磷翅目昆虫蝙蝠蛾幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，是青藏高原地区的特有物种，主产于我国西藏、青海、四川、云南、甘肃等地[2-3]。近年来由于过度采挖，导致虫草野生资源日益枯竭和高原地区本已脆弱的生态环境恶化，并且高额的利润也造成了虫草行业的种种乱象，一些假冒伪劣产品充斥市场，甚至一些街头广告也宣称出售正宗野生冬虫夏草产品，给广大消费者、患者造成严重损失。因此，开发虫草人工养殖技术或替代品，保护消费者利益，保护虫草野生资源和高原生态环境非常重要。冬虫夏草在青藏高原特有的气候条件下生长，这些条件都很难用人造环境再现，这是冬虫夏草的人工养殖一直没有取得有效突破的原因之一。但是冬虫夏草的有效成分大多在它的菌丝体或子实体中，只要能够培养出合格的菌丝体或子实体，也能达到人工培养冬虫夏草的目的,这也是现今国内研究的热点[4]。 本研究对糙米培养虫草菌丝体技术进行了实用化尝试，并对人工培养虫草菌丝体主要有效成分进行了含量测定。

1 材料与仪器

玻璃瓶为虫草子实体培养器，可以选用透明罐头瓶；冬虫夏草二代菌丝体为特意研发的适宜在稻米中培养的冬虫夏草菌种C963，母体来自西藏那曲；紫外灯消毒箱；冰箱；接种工具；酒精灯；糙米；高压锅；马铃薯；恒温箱；加湿器；干湿温度计；振荡培养箱。

2 方法与结果

虫草菌种很容易受到杂菌感染，所以必须全方位严格消毒，整个操作过程均在紫外灯下进行。将接种工具和培养器瓶口用酒精灯外焰快速烘烤以杀菌。虫草菌种必须低温避光保存，装有虫草菌原种的试管，用三层以上包装纸包裹，在冰箱里保存，温度控制在-18℃以下，在这个温度，菌种将处于休眠状态。

2.1 菌种培养

虫草菌种在高温下无法存活，因此，必须要等接种工具冷却后才能使用。将少许菌种取出，注入培养器中，培养器中已预先配有专用培养液，接种后立即封闭瓶口。接下来进行恒温培养，将接种后的培养器放于振荡培养箱中。恒温培养即低温恒温培养，是模拟冬虫夏草的野生环境，在避光条件下进行，培养过程中温度控制在16～18℃，振荡培养箱的转速设定在140r/min。待培养器中出现颗粒状菌球，菌种培养工作即完成，菌种培养的周期为3～5天。

2.2 子实体培养

虫草子实体培养器选用透明玻璃瓶，以便于观察生长境况。本实验中，虫草子实体培养基选用糙米，因为我国是稻米生产大国，在粮食运输、加工过程中不可避免会产生碎米或残次米，再加上色选机选出的杂色米和仓库里堆积的陈米，粮食企业每年都要为大量糙米的处理发愁，以往一般都是低价处理，附加值很低。本研究能有效提高糙米的附加值，提高粮食的利用率。因此，本研究特意研发了适宜在稻米中培养的冬虫夏草菌种C963，以及适合在稻米上生长的冬虫夏草培养基配方。当然，糙米不能直接作为培养基，还要进行加工，需要加入土豆汤以及其他一些添加剂，才能有助于营养成分的释放。糙米专用营养汤配好后，精密量取55mL汤汁，倒入已经装有50g糙米的玻璃瓶中，再用特殊塑料薄膜将瓶口封闭，这种特殊塑料薄膜带有4个小孔，是一种单透膜，即空气或水分只能从一个方向通过，封口时让膜的通气由瓶内到瓶外。

接下来，将封口后的玻璃瓶码放起来，送入大型高压锅中加热至124℃，经50min杀菌灭活后出锅；或加热至糙米蒸熟、土豆汤基本蒸干为宜，这时培养基的准备工作即完成。

下一步是给培养基接种，因为虫草菌种不耐高温，这项工作要等培养基完全冷却后才能进行。接种前仍然要先严格消毒，整个接种工作都要在紫外灯下进行。点燃酒精灯，将接种工具在酒精灯外焰上快速烘烤，待接种工具冷却后从菌种瓶内取出少许菌种，打开装有培养基的玻璃瓶封口，滴入菌种，快速重新装上封口。接好种的玻璃瓶要分开码放，以免混淆。

辟出专门的虫草培养间，严格消毒，装上空调、加湿器、温度计等设备，准备一些货架。与菌丝体培养需要避光不同，子实体培养需要采光。将接好种的玻璃瓶整齐码放至货架上，调整空调和加湿器，控制温度20℃、湿度80%。子实体培养期间，人员除例行检查外，尽量少进入培养间，以减少杂菌感染。如果发现培养基长出了一些黑色的东西，表明受到了感染，如果是早期，剔除这些杂菌斑即可，若感染严重应尽快将整瓶移走，以免发生传染。

研究表明，只要技术到位，2个多月就可以长出理想的虫草子实体。但这些人工培养的虫草子实体药性如何还有待检验。因为腺苷和虫草素是虫草的重要活性成分，其含量测定对人工培育虫草的质量控制有重要意义。以下对这两种有效成分进行了含量测定，以检验人工培养虫草子实体技术的实用价值。

2.3 虫草有效成分含量测定

本实验采用的实验仪器包括Agilent 1200 RRLC-UV-ELSD高效液相色谱仪，赛多利斯万分之一电子天平,OpenLAB EZchrom色谱数据管理系统;KQ-600超声波清洗器;WR-2001型溶剂过滤器,0.2μm滤膜,试剂均为分析纯,水为3次蒸馏水。

标准溶液制备:称取腺苷、虫草素对照品适量,置于同一容量瓶中,加乙醇∶水(1∶1)溶液,超声波振荡溶解,定容,配制成浓度分别为50.5mg·L-1、129.0mg·L-1的标准溶液。

虫草素(C10H13O3N5)和虫草腺苷(C10H13N5O4)是从虫草中分离得到的一类具有生物活性的化合物[5]。本研究采用HPLC法测定人工培养虫草子实体和天然冬虫夏草中虫草素和腺苷的含量，以Waters XTerra MS C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱，以甲醇-水为流动相，梯度洗脱，流速为1mL/min，检测波长为259nm，柱温为25℃，结果人工培养虫草子实体中虫草素和腺苷含量分别为1 089.57μg/g、520.00μg/g。冬虫夏草中虫草素和腺苷含量分别为

值接近甚至高于冬虫夏草，可将人工培养菌丝体作为天然冬虫夏草的替代品。色谱见图1、图2。

图1 野生虫草色谱

图2 人工培育虫草色谱

3 结语

野生冬虫夏草由于被盲目无节制采挖，现已处于濒危状态，以人工培育的虫草子实体代替野生冬虫夏草，既保持了环境资源的可持续发展，又降低了用药成本，不仅有可观的经济价值，而且有重要的社会效益。本研究表明人工培育的虫草子实体在某些药理作用方面可以替代野生冬虫夏草，但由于实验条件及实验方法的局限，对人工培育虫草子实体替代冬虫夏草还需进一步深入研究。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010.

[2] 康廷国.中药鉴定学[M].第3版.北京:中国中医药出版社,2007:432.

[3] 蒋三俊.冬虫夏草及蛹虫草寄主昆虫资源[J].特种经济动植物，2001(5):15.

[4] 康廷国.中药鉴定学[M].第2版.北京:中国中医药出版社,2007:431.

[5] 张甲生,马冰茹,何玲,等.蚕蛹虫草与冬虫夏草中无机元素的比较[J].中国食用菌,10(20):43-44.

(责任编辑：宋勇刚)

2015-05-10

莫炫永(1974-)，男，硕士，广东省东莞市国药质量检测中心主管药师，研究方向为药品、保健食品质量控制。

陈涌涛(1970-)，男，湖北省科技信息研究院助理研究员，研究方向为农业科技传播。

R284.2

A

1673-2197(2015)18-0015-02

10.11954/ytctyy.201518008