基于卵泡颗粒细胞凋亡研究归肾育宫汤对免疫性卵巢早衰小鼠的治疗作用＊

符小航 符海鸽 贺丰杰 车虹彩 杨鉴冰 崔晓萍

陕西中医药大学第二附属医院（咸阳712046）

卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）是指女性在青春期后至四十岁前发生的非生理性的月经停止，伴有潮热、原发或继发不孕、生殖器萎缩等症状的一种妇科内分泌性疾病［1］。POF的发病机制学研究表明颗粒细胞的过度凋亡是导致其发病的主要病因［2］，中医药在本病的治疗去取得了良好的疗效，陕西省名中医杨鉴冰教授依据中医“肾主生殖”理论，创立了归肾育宫汤，临床治疗卵巢早衰取得了良好的效果［3－4］。实验研究表明该方具有调节性激素水平的作用，对免疫学小鼠POF治疗作用显著［5］，本实验拟观察归肾育宫汤对免疫性卵巢早衰小鼠卵泡颗粒细胞凋亡及凋亡调控基因Bcl－2／Bax蛋白表达的影响，现将研究结果汇报如下。

1 材 料 1.1 动 物 SPF级雌性昆明小鼠90只，体重（20±5）g，动物合格证号：SCX（陕）2007－001，购自西安交通大学医学科研实验动物中心。

1.2 药 物 归肾育宫汤组方：菟丝子20g，山药、茯苓、制首乌、鸡血藤、焦山楂各15g，枸杞子、川断各12g，熟地、山萸肉、鹿角霜、紫河车、杜仲各10g，炙甘草6g，所有中药购于陕西中医学院第二附属医院中药房，经检验为合格药物，常规煎煮，浓缩后备用；结合雌激素片：美国辉瑞公司，批号：14040201。

1.3 试 剂 透明带多肽3（ZP3）：南京金斯瑞生物科技有限公司，批号：5004321＿2；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂：美国西格玛生物科技公司；Bcl－2、Bax一抗：北京博奥森生物技术有限公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（批号：14137200），瑞士罗氏公司。

1.4 仪 器 与 设 备 图 像 采 集 系 统：NIKON.ACT－1 DXM1200日本尼康公司；光学显微镜：蔡司光学仪器（上海）国际贸易公司。

2 方 法 2.1 卵巢早衰（POF）模型制备 透明带多肽溶液的配制：按每1.4445mg透明带多肽粉（ZP3）配1mL三蒸水；免疫试剂和免疫强化试剂的配制：将ZP3溶液分别与弗氏完全佐剂和弗式不完全佐剂按1∶1比例配制成免疫试剂和免疫强化试剂；模型的复制：分别于第1天和第14天取0.1mL免疫试剂和免疫强化试剂多点注射于小鼠双后脚掌及腹腔。

2.2 动情周期观察 从免疫试剂注射后第1天起，每天上午用蘸生理盐水的棉签放入小鼠阴道，取阴道脱落细胞，涂片后吉姆萨染色，在光学显微镜下观察动情周期的变化，若出现动情周期的紊乱则表示造模成功。

2.3 分组及给药 将90只雌性小鼠称重后按照体重编号，完全随机法分为空白对照组、模型对照组、雌激素组、归肾育宫汤大、中、小剂量组，每组15只。雌激素组用结合雌激素片0.125mg／（kg·d）；各中药治疗组按归肾育宫汤大剂量组70g／（kg·d）、中剂量组35g／（kg·d）、小剂量组17.5g／（kg·d）灌胃，空白对照组、模型对照组给予生理盐水灌胃，给药4周。

2.4 TUNEL染色检测细胞凋亡 TUNEL染色按照试剂盒说明书操作，主要操作步骤如下：常规石蜡切片脱蜡入水→蛋白酶K工作液21～37℃处理组织15min，PBS洗3min，3次→加TUNEL反应混合液（含TdT酶和dUTP的标记液），置于暗湿盒中37℃标记1h→PBS洗5min，5次→加封闭液，置于暗湿盒中37℃反应30min→PBS洗5min，5次→加DAB底物，15－25℃反应5min，镜下浅棕色即可→PBS洗5min，5次→光镜下观察凋亡细胞并拍照。用光学显微镜观察凋亡细胞，随机选取5个视野结合凋亡细胞形态特征综合判断，对凋亡细胞进行计数。

2.5 卵泡颗粒细胞Bcl－2、Bax蛋白表达的测定 取小鼠卵巢，常规切片，脱蜡脱水，3%H2O2室温孵育5～10min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min x2，5～10%山羊血清封闭，室温孵育10min，一抗4℃过夜，二抗37℃孵10～30min，滴加碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10～30min，显色剂显色3～15min，冲洗、复染、脱水、透明、封片后显微镜下观察。采用Zeiss Imerger Al显微镜观察，采用DXM1200FCCD图像采集系统采集图片，应用Image－Pro Plus5.1图像分析系统测定其积分光密度。

2.6 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，对所有数据进行正态性、方差齐性检验，若方差齐多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为有统计学意义。

3 结 果 3.1 TUNEL法检测归肾育宫汤对卵巢早衰小鼠卵泡颗粒细胞凋亡的影响 TUNEL标记的阳性凋亡结肠上皮细胞呈深棕色，正常卵泡颗粒细胞呈蓝色。空白对照组小鼠卵泡颗粒细胞偶见凋亡，模型对照组小鼠卵泡颗粒细胞凋亡显著增多（P＜0.05），表明由于卵泡颗粒细胞的过度凋亡最终导致了卵巢功能低下，形成卵巢早衰。结果见表1。

表1 归肾育宫汤对卵巢早衰小鼠卵泡颗粒细胞凋亡数的影响（±s）

表1 归肾育宫汤对卵巢早衰小鼠卵泡颗粒细胞凋亡数的影响（±s）

注：与空白对照组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01；与模型对照组比较，◇P＜0.05，◆P＜0.01；与雌激素组比较，○P ＜0.05，●P ＜0.01；与大剂量组比较，☆P ＜0.05，★P ＜0.01

组 别 剂量kg·dTUNEL染色凋亡细胞计数（个）－－ 2.2±1.06模型对照组 －－ 45.36±4.28▲雌激素组 0.125mg 15.16±3.27◆归肾育宫汤大剂量组 70g 6.69±3.25◆●归肾育宫汤中剂量组 35g 10.26±3.57◆○归肾育宫汤小剂量组 17.5g 18.82±4.41空白对照组◆★

3.2 归肾育宫汤对卵巢早衰小鼠卵泡颗粒细胞Bcl－2、Bax蛋白表达的影响 表明雌激素、归肾育宫汤大、中、小剂量组药物可通过调节胞Bcl－2和Bax蛋白的表达对卵泡颗粒细胞的过度凋亡起到抑制作用。结果见表2。

表2 各组大鼠结肠上皮细胞Bcl－2、Bax蛋白积分光密度（IOD）的比较（±s）

表2 各组大鼠结肠上皮细胞Bcl－2、Bax蛋白积分光密度（IOD）的比较（±s）

注：与空白对照组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01；与模型对照组比较，◇P＜0.05，◆P＜0.01；与雌激素组比较，○P ＜0.05，●P ＜0.01；与大剂量组比较，☆P ＜0.05，★P ＜0.01

－－ 12535.62±892.31 10015.58±895.21模型对照组 －－ 5043.52±873.17▲ 20153.85±971.86▲雌激素组 0.125mg 7614.57±874.12◆ 17471.16±852.47◆归肾育宫汤大剂量组 70g 10931.19±941.56◆● 13745.45±837.64◆●归肾育宫汤中剂量组 35g 9635.26±825.38◆● 13861.32±825.36◆●归肾育宫汤小剂量组 17.5g 7032.12±802.31◆★ 17985.42±887.56 Bax空白对照组组 别 剂量（kg·d） Bcl－2◆★

4 讨 论 细胞凋亡是指在一定的生理或病理条件下，细胞接受机体刺激信号后出现的一种主动的、受凋亡相关基因控制的细胞程序性死亡。卵泡颗粒细胞是维持卵巢功能的主要细胞，卵泡数量的多少与卵泡颗粒细胞密切相关，卵泡颗粒细胞的增殖和分化是卵泡不断发育至成熟的基本条件，卵泡颗粒细胞还是是雌激素、孕激素的重要来源，因此它的凋亡引起卵泡数量减少，激素水平降低并最终导致卵巢早衰的发生［6］。研究表明，卵巢早衰妇女卵泡数量急剧减少，不能分泌足够的激素及生长因子并伴有显著的卵泡数量减少，最终导致卵巢早衰。Bcl－2和Bax蛋白在诱导凋亡的线粒体信号传导途径中起着重要的作用，Bcl－2蛋白是细胞凋亡的抑制基因，Bax是Bcl－2的同源蛋白，是一种凋亡诱导基因。Bcl－2和Bax蛋白是抑制细胞凋亡的重要靶蛋白。归肾育宫汤是临床治疗卵巢早衰疗效确切的方剂，为明确该方是否能通过影响卵巢颗粒细胞凋亡对卵巢早衰发挥治疗作用，本实验采用ZP3溶液多点注射的方式成功复制了POF小鼠动物模型，模型成功后可见卵泡颗粒细胞凋亡的明显增多，经给药治疗后，可见归肾育宫汤大、中、小剂量组小鼠卵泡颗粒细胞凋亡显著减少，与雌激素组比较发现归肾育宫汤大、中剂量组药物疗效优于雌激素，表明归肾育宫汤能有效抑制卵泡颗粒细胞凋亡对POF起到治疗作用。通过对Bcl－2和Bax蛋白检测表明，归肾育宫汤抑制卵泡颗粒细胞凋亡的作用机制主要与Bcl－2和Bax蛋白的表达有关。

［1］ 刘震坤，金 影，董克勤，等.卵巢早衰实验研究进展［J］.吉林中医药，2013，33（7）：754－755.

［2］ 叶 娜，董晓英，李冬华.卵巢早衰的颗粒细胞凋亡机制研究进展［J］.首都医科大学学报，2014，35（3）：379－383.

［3］ 任洁宁，杨鉴冰.杨鉴冰教授治疗卵巢早衰用药经验介绍［J］.现代中医药，2009，25（3）：1－2.

［4］ 杨鉴冰.补肾育宫汤配合西药治疗卵巢早衰22例［J］.陕西中医，2009，30（7）：773－774.

［5］ 符小航，连李斌，康汝光，等.归肾育宫汤对免疫性卵巢早衰小鼠外周血清性激素的影响［J］.陕西中医，2014，35（10）：1428－1429.

［6］ 李亚丽，楚 伟，王方娜.何首乌饮对衰老大鼠卵巢组织凋亡相关蛋白 Bax／Bcl－2及 Caspase－3表达的影响［J］.中国新药杂志，2011，20（18）：1791－1794.