用于水酶法提取中碳链油脂菌株的筛选与鉴定

肖彦骏，曾 诚，马毛毛，曾哲灵，3，*，余 平，3，钟卫民

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.南昌大学第一临床医学院，江西南昌330031；3.南昌大学资源环境与化工学院，江西南昌330031；4.抚州职业技术学院，江西抚州344106）

用于水酶法提取中碳链油脂菌株的筛选与鉴定

肖彦骏1，曾 诚2，马毛毛1，曾哲灵1，3，*，余 平1，3，钟卫民4

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.南昌大学第一临床医学院，江西南昌330031；3.南昌大学资源环境与化工学院，江西南昌330031；4.抚州职业技术学院，江西抚州344106）

筛选和应用产中性蛋白酶能力强、产脂肪酶能力很弱的耐中碳链脂肪酸型菌株，是提高水酶法提取樟树籽仁油产品得率及质量的关键。使用樟树籽仁粕粉平板富集，脱脂奶平板法、油脂平板法初筛，福林酚法、樟树籽仁培养基摇瓶复筛等方法，自樟树籽仁油生产废渣中筛选出产中性蛋白酶活力达4536.5 U/mL、产脂肪酶活力只有0.088 U/mL、适用于水酶法提取樟树籽仁油等中碳链油脂的菌株Z16。经过形态学、生理生化特征及16S rDNA分子生物学鉴定，确定菌株Z16为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。解淀粉芽孢杆菌Z16所产中性蛋白酶在50℃温度下的酶活力最高，Mn2＋对其有明显的激活作用，其适宜酶解温度为40～45℃、适宜酶解pH为7.0。

菌株，筛选，鉴定，中碳链油脂，水酶法提取

樟树籽仁油的中碳链脂肪酸甘油酯含量高于94%，为天然中碳链油脂，具有减少体内脂肪沉积、降低血脂和血糖水平等作用，既是保健作用显著的功能食用油，也是生产新一代肠外营养剂——结构脂质（Structure Lipids，SLs）的优良原料[1-3]。水酶法提取植物油脂技术，不仅提取条件温和、能耗低、过程安全、油脂得率较高（大于90%），而且能同时能获得高品质的植物油脂和植物蛋白，体现了油脂研发与生产领域的发展方向[4-5]。水酶法提取植物油脂中使用的中性蛋白酶基本上为枯草芽孢杆菌AS1.398、栖土曲霉3942、放线菌166等菌株所生产的。研究发现，采用这些菌株所产的中性蛋白酶液进行水酶法提取樟树籽仁油，樟树籽仁油的得率小于83%、酸价大于5 mg KOH/g。造成樟树籽仁油得率低、酸价高的原因是樟树籽仁油中的中碳链脂肪酸及其甘油酯对枯草芽孢杆菌AS1.398等革兰氏阳性菌、霉菌及生物酶具有较强的抑制作用[6-9]。因此筛选及应用可在樟树籽仁油等中碳链油脂培养基中生长、产中性蛋白酶能力强而基本不产脂肪酶的菌株，是提高水酶法提取樟树籽仁油等中碳链油脂产品得率及质量的关键。但国内外至今还未见有关成功筛选出产蛋白酶能力强而产脂肪酶能力很弱的耐中碳链脂肪酸型菌株的文献报道。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

樟树籽仁油生产废渣 南昌香樟林高科技有限公司；餐饮废水 南昌大学学生食堂；腐乳胚料 南昌久鸿食品有限公司；樟树籽、玉米粉、麸皮、豆粕、脱脂奶粉 均为市售；Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Na2CO3、NaCl、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、琼脂、干酪素、福林酚、三氯乙酸 均为分析纯。

FA1604型电子天平 德国赛多利斯有限公司；XMT1-8112型电热恒温水浴锅、TQZ-312型台式全温振荡器、全自动高压灭菌锅、SKP-02420型电热恒温培养箱 均来自上海精宏实验设备有限公司；超净工作台 吴江市净化设备总厂；HS-2F型pH仪 上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂；TGL-16G型高速离心机 上海安亭科学仪器厂；XSZ-4G型中级生物显微镜、WFZ765PC型紫外可见分光度计 重庆光电仪器有限公司。

1.2 培养基

1.2.1 樟树籽仁粉的制备 将樟树籽脱皮、脱壳，称取一定量樟树籽仁，以料液比1∶2与水混合，加入到胶体磨中湿法粉碎乳化4 min，得到的白色乳状液，喷雾干燥得到樟树籽仁粉（含油量57.96%）。

1.2.2 樟树籽仁培养基A 樟树籽仁粉2%，葡萄糖0.7%，KH2PO40.03%，Na2HPO4·12H2O 0.4%，琼脂2%，pH7.0±0.2，115℃灭菌25 min。

1.2.3 樟树籽仁培养基B 樟树籽仁粉5%，葡萄糖0.7%，酵母粉0.3%，KH2PO40.03%，Na2HPO4·12H2O 0.4%，pH7.0±0.2，115℃灭菌25 min。

1.2.4 肉汤培养基 蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH7.0±0.2，121℃灭菌20 min。

1.2.5 脱脂奶培养基 在普通肉汤固体培养基中添加终质量比为1.5%脱脂奶粉。脱脂奶粉用水溶解后单独灭菌，115℃灭菌25 min，铺平板前再与加热融化了的肉汤固体培养基混合。

1.2.6 樟树籽仁油培养基 蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，樟树籽仁油1.2%，1.6%中性红水溶液0.1%，琼脂2%，pH7.0±0.2，121℃灭菌20 min[10]。

1.2.7 基础发酵培养基 玉米粉4%，麸皮2.5%，豆粕3%，KH2PO40.03%，Na2HPO4·12H2O 0.4%，pH7.0± 0.2，121℃灭菌20 min[11]。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株初筛

1.3.1.1 耐中碳链脂肪酸型菌株富集 称取1 g左右分离源样品，用无菌生理盐水和10倍稀释法，制备不同稀释度（10-1～10-7）的稀释液，从三个合适稀释度中吸取100 μL稀释液均匀涂布到樟树籽仁培养基A平板上，每个稀释度做四个平行实验。37℃恒温培养24 h，选取长有10个左右菌落的平板备用。

1.3.1.2 高产蛋白酶菌株初筛 采用点种法，用无菌牙签沾取上一步骤中得到的菌落点种到脱脂奶培养基平板上，37℃恒温培养24 h，根据培养基中菌落透明圈直径与菌落直径比（H/C）大小进行产蛋白酶菌株初筛，选取H/C较大的菌株备用。

1.3.1.3 低产脂肪酶菌株初筛 采用点种法，将上一步骤中H/C较大的菌株点种到樟树籽仁油培养基平板上，37℃恒温培养24 h，观察菌落周围是否产生红色水解圈。选取无红色油脂水解圈的菌株进行摇瓶复筛。

1.3.2 高产中性蛋白酶、低产脂肪酶菌株复筛 将初筛得到的菌株接种到肉汤培养基中，37℃、220 r/min摇瓶培养24 h，制成种子液。以4%的接种量将种子液加入到基础发酵培养基中。37℃、220 r/min摇瓶培养48 h，取发酵液，8000 r/min离心分离10 min，上清液即为粗酶液。采用国标GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂酶活力测定方法》中规定的福林酚法，测定粗酶液中性蛋白酶活力，并测定中性蛋白酶活力超过1500 U/mL粗酶液的脂肪酶活力，脂肪酶活力采用国标GB/T 23535-2009《脂肪酶制剂酶活测定方法》中规定的酸碱滴定法测定。选取产蛋白酶活力高、脂肪酶活力低的菌株。

1.3.3 用于水酶法提取中碳链油脂的菌株筛选 将上一步骤中复筛得到的菌株接种到肉汤培养基中，37℃、220 r/min摇瓶培养24 h，制成种子液。以4%的接种量将种子液加入到樟树籽仁培养基B中，37℃、220 r/min摇瓶培养48 h后，90℃保温10 min灭活，胶体磨湿法粉碎乳化4 min，将得到的白色乳状液4000 r/min离心分离25 min，收集底层渣相，干燥后得到樟树籽仁残渣，称重并采用索氏提取法测定其含油量[12]。空白组中加入灭活的种子液，其他步骤同实验组。选取最能使樟树籽仁残渣量少、含油量低的菌株。

1.3.4 菌种鉴定

1.3.4.1 菌株形态鉴定 将菌株稀释后涂布于营养琼脂培养基上，培养皿培养24 h后，肉眼观察菌落形状、颜色、大小和突起等特征。对菌株进行革兰氏染色，显微镜下观察菌株的细胞形态。

1.3.4.2 菌株的生理生化特征鉴定 参照文献[13]。

1.3.4.3 菌株16S rDNA分子生物学鉴定 参照文献[14]。使用上海生工生物工程股份有限公司提供的Ezpu柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株基因组DNA。以提取的DNA为模版，采用细菌16SrRNA基因通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT）进行PCR扩增。PCR反应体系为：上下游引物各0.5 μL，DNA模版0.5 μL，Taq Mix 3.7 μL，加ddH2O至25.0 μL。扩增反应程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共进行30个循环，72℃延伸修复10 min。扩增完成后的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收后用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒纯化，并送至上海生工生物工程有限公司测序。

1.3.5 菌株所产蛋白酶的酶学性质测定 在不同pH（分别为5、6、7、8、9、10、11）条件下分别测定菌株所产蛋白酶活力，确定其最适作用pH；在不同温度（分别为35、40、45、50、55、60、65、70℃）条件下分别测定菌株所产蛋白酶活力，确定其最适作用温度；在不同温度（分别为40、45、50、55℃）保温不同时间（10、30、60、90 min）后测定菌株所产蛋白酶活力，确定其热稳定性能；在菌株所产粗酶液中添加0.02 moL/mL不同的金属离子后检测菌株所产蛋白酶活力，确定不同金属离子对其激活作用[15]。

1.3.6 数据分析 数据表示采用六次测试所获的平均值±标准偏差。通过使用统计程序软件（SPSS 19.0）方差分析法（ANOVA分析）与随后的单独样品抽样t检测用来进行比较。如果p＜0.05，则差异被认为是系统上显著。

2 结果与讨论

2.1 菌种筛选

菌株筛选结果列于表1中。由表1可知，经过耐中碳链脂肪酸富集、高产蛋白酶菌株初筛及低产脂肪酶菌株初筛，从樟树籽仁油生产废渣筛选出耐中碳链脂肪酸、H/C值大于3.5、无油脂水解圈的菌株17株，从食堂废水筛选出耐中碳链脂肪酸、H/C值大于2.0、无油脂水解圈的菌株3株，从腐乳胚料中筛选出耐中碳链脂肪酸、H/C值大于2.0、无油脂水解圈的菌株3株。经过高产中性蛋白酶、低产脂肪酶菌株复筛，从来初筛菌株中复筛出高产中性蛋白酶（＞2500.0 U/mL）、低产脂肪酶（＜0.150 U/mL）的菌株3株（Z9、Z16、Z17），这3株菌株皆来源于樟树籽仁油生产废渣。

从Z9、Z16和Z17三株菌株中，筛选可用于水酶法提取樟树籽仁油的菌株，其结果列于表2中。由表2可知，在水酶法提取樟树籽仁油中，菌株Z16最能降低樟树籽仁残渣的量及其含油量，也就说明该菌株提高樟树籽仁油得率的效果最佳，适用于水酶法提取樟树籽仁油。

2.2 菌种鉴定

菌株Z16在营养琼脂培养基上培养24 h后，菌落呈圆形，直径5.0～10.0 mm，厚度约2.0 mm，表面为浅黄色，有不规则波状突起，边缘平滑。革兰氏染色为阳性，在显微镜下观察细胞形态为杆状，长度0.7～0.9 μm，直径3.0～5.0 μm，内生芽孢，无伴孢晶体，芽孢常见于细胞中部，孢子囊无明显膨胀。

表1 耐中碳链脂肪酸、高产蛋白酶、低产脂肪酶菌株筛选结果Table 1 Results of high neutral protease-producing and low lipase-producing strain screening

表2 水酶法提取樟树籽仁油用菌株复筛结果Table 2 Results of strain screening for camphor tree seed kernel oil extracted by aqueous enzymatic extraction

菌株Z16的生理生化实验结果列于表3中。

菌株Z16的16S rDNA琼脂糖凝胶电泳图绘于图5中。

菌株Z16的16S rDNA基因序列为：

GGTGCTATAATGCAAGTCGAGCGGACAGATG GGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTG AGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGA TAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTT GTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCT TCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGAC GATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACA CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTT TCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAA GTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACC TAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGA ATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTT AAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGA GGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAG AGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGC GTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG ACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAA GCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGG GGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAA GCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAA ACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGA ACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAG AGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAG GTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAT GTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGA TCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGT GACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCT ACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAG CGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTG TTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCG TGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAT GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACAC CGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAA GTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCGA AGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGAACAA GTTGT

图1 菌株Z16蛋白酶水解圈形态Fig.1 Protease hydrolysis circle shape of strain Z16

图2 菌株Z16菌落形态Fig.2 Colony morphology of strain Z16

图3 菌株Z16细胞形态Fig.3 Cell morphology of strain Z16

图4 菌株Z16革兰氏染色结果Fig.4 Gram staining results of strain Z16

表3 菌株Z16的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain Z16

图5 菌株Z16的16S rDNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.5 The 16S rDNA agarose gel electrophoresis pattern of Z16

将菌株Z16的16S rDNA基因序列与NCBI中的数据库进行基因序列同源性Blast比对，结果显示菌株Z16与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的同源性达99%。综合分析菌落形态、菌株细胞形态、生理生化实验结果、基因序列对比结果，确定菌 株 Z16为一株解 淀粉芽 孢杆 菌（Bacillus amyloliquefaciens），并命名为解淀粉芽孢杆菌Z16（Bacillus amyloliquefaciens Z16）。

淀粉芽孢杆菌Z16的产中性蛋白酶能力，比近几年文献报道的枯草芽孢杆菌N19（产中性蛋白酶活力为158 U/mL）[16]、枯草芽孢杆菌Bx-4（产中性蛋白酶活力为2519.4 U/mL）[11]的产蛋白酶能力高很多，也高于国内常用于生产中性蛋白酶制剂的出发菌株——枯草芽孢杆菌AS1.398（产中性蛋白酶能力2000 U/mL左右）、栖土曲霉3942（产中性蛋白酶能力为3000 U/mL左右）、放线菌166（产中性蛋白酶能力4000 U/mL）的产蛋白酶能力[17-18]。而解淀粉芽孢杆菌Z16的产脂肪酶活力大幅低于国内常用于生产中性蛋白酶制剂的出发菌株的产脂肪酶能力（大于30 U/mL）。因此，解淀粉芽孢杆菌Z16适用于水酶法提取樟树籽仁油等中碳链油脂。

2.3 解淀粉芽孢杆菌Z16所产蛋白酶的酶学性质

2.3.1 pH对解淀粉芽孢杆菌Z16所产蛋白酶活力的影响 如图6所示，当pH为7时，菌株所产蛋白酶活力最高。该酶的适宜pH为6.5～7.5，最佳pH为7，属于中性蛋白酶，适宜水酶法提取植物油脂的pH环境。

图6 pH对解淀粉芽孢杆菌Z16所产蛋白酶活力影响Fig.6 The effect of pH on protease produced by Bacillus amyloliquefaciens Z16

2.3.2 温度对解淀粉芽孢杆菌Z16所产蛋白酶活力的影响 温度对解淀粉芽孢杆菌Z16所产蛋白酶活力的影响如图7所示，当温度低于50℃时，菌株所产蛋白酶活力随温度的升高而增高，50℃时菌株所产蛋白酶活力最高，为40℃时的179.6%；当温度超过55℃，菌株所产蛋白酶活力随温度升高而迅速降低。这是因为，蛋白酶既是一种催化剂也是一种蛋白质，在某一温度范围内，酶的催化活力会随着温度的升高而升高，温度过高将导致蛋白酶变性而丧失催化活性。

图7 温度对解淀粉芽孢杆菌Z16所产蛋白酶活力影响Fig.7 The effect of temperature on protease produced by Bacillus amyloliquefaciens Z16

2.3.3 解淀粉芽孢杆菌Z16所产蛋白酶的热稳定性解淀粉芽孢杆菌Z16所产蛋白酶的热稳定性如图8所示，当温度分别为40℃和45℃时，保温90 min后，菌株所产蛋白酶的活力分别为初始酶活力的87.9%和55.7%，当温度达到50℃及以上时，菌株所产蛋白酶活力随时间的延长而快速降低。结合图7可确定，解淀粉芽孢杆菌Z16所产蛋白酶的最适宜作用温度为40～45℃。

图8 解淀粉芽孢杆菌Z16所产中性蛋白酶的热稳定性Fig.8 The thermostability of protease produced by Bacillus amyloliquefaciens Z16

2.3.4 金属离子对解淀粉芽孢杆菌Z16所产蛋白酶活力的影响 金属离子对解淀粉芽孢杆菌Z16所产蛋白酶活力的影响如图9所示，Mn2＋可以显著提高菌株所产蛋白酶活力（较空白组提高46.5%）。这是因为大多数微生物所产中性蛋白酶都是金属蛋白酶，其活性中心常含有一个金属离子如Zn2＋、Mn2＋、Mg2＋、Co2＋、Fe3＋、Cu2＋等。金属蛋白酶中的金属离子可被透析或者金属螯合物所螯合而失活，而这一过程通常是可逆的，可通过重新加入金属离子恢复部分或者全部蛋白酶活力[17]。

图9 金属离子对解淀粉芽孢杆菌Z16所产中性蛋白酶活力的影响Fig.9 The effect of metal icons on protease produced by Bacillus amyloliquefaciens Z16

3 结论

从三种分离源中初筛出23株H/C值较大、无油脂水解圈的菌株，并从中复筛出高产中性蛋白酶（＞2500.0 U/mL）、低产脂肪酶（＜0.150 U/mL）且耐中碳链脂肪酸的菌株3株（Z9、Z16、Z17），这3株菌株皆来源于樟树籽仁油生产废渣。其中，菌株Z16产中性蛋白酶活力最高，达到4536.5 U/mL，产脂肪酶活力很低，只有0.088 U/mL。通过形态学、生理生化特征及16S rDNA分子生物学鉴定，确定菌株Z16为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。解淀粉芽孢杆菌Z16所产蛋白酶为金属蛋白酶、中性蛋白酶，Mn2＋为其激活剂，在50℃下的酶活力最高，其最适作用温度为40～45℃、最适作用pH为7.0。

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Screening and identification of strains for aqueous enzymatic extraction of medium-chain triglycerides

XIAO Yan-jun1，ZENG Chen2，MA Mao-mao1，ZENG Zhe-ling1，3，*，YU Ping1，3，ZHONG Wei-min4
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.School of Medicine，The First Medical College，Nanchang University，Nanchang 330031，China；3.School of Environmental and Chemical Engineering，Nanchang University，Nanchang 330031，China；4.Fuzhou Vocational Technical College，Fuzhou 344106，China）

Strains which had ability of higher neutral protease and lower lipase production，resistance to mediumchain fatty acids，was the key to improve yield and quality of camphor tree seed kernel oil by aqueous enzymatic extraction technology.Strain Z16 was isolated from waste residue in camphor tree seed kernel oil by screening methods（camphor tree seed kernel plate for enrichment，skim milk and oil medium plate for primary screening，Folin phenol and camphor tree seed kernel oil medium shaking for re-screening）.The results showed that neutral protease and lipase production capability of Z16 were 4536.5 U/mL and 0.088 U/mL，respectively. Z16 was identified as Bacillus amyloliquefaciens by morphological，physiological and 16S rDNA.Bacillus amyloliquefaciens had maximum neutral protease activity at 50℃，and was activated by Mn2+.The optimum temperature and pH for neutral protease were 40～45℃and 7.0，respectively.

strains；screening；identification；medium-chain triglycerides；aqueous enzymatic extraction

TS201.3

A

1002-0306（2015）22-0173-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.028

2015－04－17

肖彦骏（1990-），男，在读研究生，研究方向：应用微生物学，E-mail：thinkreed@126.com。

*通讯作者：曾哲灵（1965-），男，博士，教授，研究方向：食物资源开发与生物质转化，E-mail：zlzhengjx@163.com。

国家国际科技合作专项项目（2011DFA32770）；江西省国际科技合作项目（20112BDH80004，20123BDH80011）；南昌市对外科技合作项目（211-DWHZ-SWYY-001）；江西省科技支持计划重大项目（20143ACG70015）；江西省高等学校科技落地计划项目（KJLD12012）；江西省教育厅产学研合作项目（GJJ11003）；江西省科技支撑计划项目（GJJ11003）。