呋喃它酮代谢物直接竞争化学发光酶免疫分析法的建立

吕月霞，王 瑞，黄登宇，*，王云贵，李 涛

（1.山西大学，生命科学学院，山西太原030006；2.深圳易瑞生物技术有限公司，广州深圳518101；3.山西先锋科技开发有限公司，山西太原030006）

呋喃它酮代谢物直接竞争化学发光酶免疫分析法的建立

吕月霞1，王 瑞1，黄登宇1，*，王云贵2，李 涛3

（1.山西大学，生命科学学院，山西太原030006；2.深圳易瑞生物技术有限公司，广州深圳518101；3.山西先锋科技开发有限公司，山西太原030006）

采用以对碘苯酚为增强剂的鲁米诺-辣根过氧化物酶-过氧化氢化学发光检测体系，建立检测动物组织中呋喃它酮代谢物5-吗啉甲基-2-氨基-2-僫唑烷基酮（AMOZ）残留的直接竞争化学发光酶免疫分析法（dc-CLEIA）。结果表明：此方法IC50为0.62 ng/mL，检测限为15.52 pg/mL，线性范围0.038～9.78 ng/mL，变异系数均小于10%；该方法中抗体除了与呋喃它酮原药有一定交叉外，与其他结构类似物无交叉，表现了良好的特异性；鸡肉样品添加回收率为83%～94%，验证了该方法的准确性，为实际动物组织中AMOZ残留提供了便捷、准确、快速筛查的手段。

呋喃它酮代谢物，直接竞争化学发光酶免疫分析法，鸡肉

兽药残留是影响食品安全问题最主要也是最严重的因素之一[1]。硝基呋喃类药物对革兰氏阴性和阳性菌都有抗菌作用，破坏细菌体内氧化还原酶使细菌正常代谢紊乱，起到很好的杀菌作用[2-4]。呋喃它酮主要用来治疗动物肠道感染疾病，也可作为促进生长的添加剂，呋喃它酮及其代谢物能够诱导机体基因突变，且能诱发癌症[5]。欧盟1995年规定动物性食品中禁止使用硝基呋喃类药物[6]，美国FDA 2002年公布的进口动物性食品中禁用11种药物清单中就包括呋喃西林和呋喃唑酮[7]，我国农业部2002年在235号文件《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定呋喃它酮和呋喃唑酮在所有可食性动物组织中都不得检出[8]。硝基呋喃类药物进入动物体内会很快分解和代谢，其代谢物可与蛋白质形成稳定且长期存在的结合物，烧烤、微波加热和蒸煮等方式无法有效降解，人们食用后在胃酸作用下经过水解，使其代谢物与蛋白质分离，从而对人体产生危害，故检测其代谢物更有意义[9-11]。

目前，硝基呋喃类代谢物检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、免疫分析法[12-15]等。高效液相色谱法及其联用技术虽检测结果准确，但需要专业技术人员操作且过程复杂、设备昂贵。化学发光酶免疫分析法将化学发光法和酶免疫分析法结合起来[16-17]，具有检测灵敏度高、特异性强、且操作简单方便等优点，更适用执法人员现场快速检测。杨武英等[15]建立了虾肉中呋喃它酮代谢物化学发光酶免疫分析方法，IC50为1.38 ng/mL，LOD为0.09 ng/mL。2013年，何方洋等[18]用间接竞争CLEIA法制备呋喃它酮代谢物检测试剂盒，畜禽组织和水产品LOD为0.1 ng/mL，2014年[19]用“包被抗原-酶标抗体”直接CLEIA法制备试剂盒，IC50为0.198 ng/mL。冯才伟等[20]用间接竞争CLEIA法，对猪肉、猪肝、鸡肉等样品呋喃它酮代谢物进行了检测，LOD为0.086～0.094 ng/mL。Ying-Chun Liu等[21]对鱼肉、鸡蛋、蜂蜜等样品中该物质进行了检测，LOD为0.01 ng/mL。本文对呋喃它酮代谢物AMOZ进行衍生化，活化酯法合成酶标抗原，建立“包被抗体-酶标抗原”直接竞争CLEIA法，对实验中包被抗体稀释倍数、酶标抗原稀释倍数、包被条件、封闭液、竞争时间参数进行优化，从精密度、准确性、特异性方面对该方法进行评估，以期得到一种适用于实际样品快速筛查的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

AMOZ单克隆抗体 北京艾旗斯德科技有限公司提供；5-吗啉-3-[（2-硝基基苯基）-甲基]氨基-2-唑烷酮（NPAMOZ）标准品（99.9%）、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃妥因、AMOZ、氨基脲（SEM）、3-氨基-2-恶唑烷酮（AOZ）、1-氨基乙内酰脲（AHD）、N-羟基琥珀亚胺（NHS）、鲁米诺、碳化二亚胺（DCC）、卵清蛋白（OVA）、辣根过氧化物酶（HRP）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、2-硝基苯甲醛、对醛基苯甲酸（4-CBA）、1-（2硝基苯亚甲基）-氨基乙内酰脲（NPAHD）、1-（2硝基苯亚甲基）-氨基乙内酰脲（NPAOZ）、2-硝基苯亚甲基-氨基脲（NPSEM） 美国Sigma公司；KCl、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaCl、对碘苯酚、对甲苯酚、过氧化氢脲、乙酸乙酯、正己烷 国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯；鸡胸肉 市购。

BSA224S电子天平 德国Sartorius公司；单道微量移液器 0.5～10 μL、10～100 μL、96孔可拆卸化学发光板，美国Thermo公司；8通道移液器 30～300 μL，德国Eppendorf公司；1000～5000 μL移液器 大龙兴创实验仪器有限公司；UPT-I-10T超纯水机 四川优普超纯科技有限公司；SC-3610低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；UV-1600PC紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；INFINITE 200PRO酶标仪 瑞士Tecan公司；AVANCE 600MHZ超导核磁共振波谱仪 德国Bruker公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液系统 包被缓冲液（pH9.6，0.05 mol/L）、PBS缓冲液（pH7.4，0.01 mol/L）、PBST洗涤液（pH7.4，0.01 mol/L）、封闭液、终止液均参照文献[15]方法配制。鲁米诺储备液（0.25 mol/L）：0.4429 g鲁米诺，溶于10 mL DMF。过氧化氢脲储备液（0.3 mol/L）：0.2822 g过氧化氢脲溶于10 mL超纯水。对碘苯酚储备液（0.01 mol/L）：0.0220 g对碘苯酚溶于10 mL DMF。对甲苯酚储备液（0.01 mol/L）：0.0108 g对甲苯酚溶于10 mL DMF。

1.2.2 AMOZ衍生物半抗原5-吗啉-3-[（4-羧基苯基）-甲基]氨基-2-僫唑烷酮（CPAMOZ）的合成75.0 mg AMOZ溶于937.5 μL 0.1 mol/L HCl，得溶液A；60.0 mg对醛基苯甲酸4-CBA溶于937.5 μL DMF，得溶液B；A与B混匀后室温反应48 h。混合液4500 r/min离心10 min，弃上清液，乙醇洗沉淀3次，烘干，得白色固体粉末CPAMOZ[22]。

1.2.3 酶标抗原的合成 30.0 mg CPAMOZ，15.8 mg NHS，28.5 mg DCC，混合溶于350 μL DMF，室温下反应16 h，得溶液D。19.6 mg辣根过氧化物酶HRP，溶于1 mL pH7.4的PBS，加入D溶液，4℃反应过夜。混合液转移到透析袋，室温下PBS透析5 d，每隔8 h换一次透析液。透析后混合液4500 r/min离心15 min，上清液加入等体积甘油，分装，－20℃保存备用[23]。

1.2.4 直接竞争化学发光酶免疫分析法（dc-CLEIA）检测步骤 单克隆抗体用碳酸盐缓冲液（CBS）包被液稀释后依次加入到96孔化学发光板中，100 μL/孔，孵育2～16 h。PBST洗板3次。每孔200 μL封闭液，37℃封闭2 h，每孔依次加入50 μL梯度稀释标品NPAMOZ溶液与50 μL酶标抗原，空白对照以标品稀释液代替标品，37℃进行孵育30～150 min，洗板4次。将发光液混合后立即加入，100 μL/孔，室温下避光反应1～5 min后用INFINITE 200PRO酶标仪测化学发光值RLU。

1.2.5 dc-CLEIA各参数优化

1.2.5.1 化学发光液优化 将鲁米诺储备液、对甲苯酚和对碘苯酚储备液、过氧化氢脲储备液、30%H2O2配制成不同摩尔比的化学发光液组合，见表1，通过RLU值比较选出最佳发光液。

表1 化学发光液优化Table 1 Chemiluminescence solution optimization

1.2.5.2 化学发光板均一性测定 在化学发光板中随机抽取3条，根据1.2.4中检测步骤进行包被，封闭后加入100 μL/孔发光液，根据各孔RLU值计算孔间变异系数。

1.2.5.3 优化包被抗体和酶标抗原稀释倍数 采用棋盘法[15]进行确定，将包被抗体按1000、2000、4000、8000、16000稀释倍数纵向包被，将酶标抗原按40、80、160、320、640、1280稀释倍数横向加入酶标板，竞争物NPAMOZ浓度为100 ng/mL，以添加标品的RLU值为B，不添加标品的RLU值为B0，计算B/B0，根据B/B0比值最小选取最佳稀释倍数。

1.2.5.4 包被条件优化 在选择最佳包被抗体和酶标抗原稀释倍数基础上，设置4℃包被过夜、37℃放置2 h后4℃过夜、37℃放置2 h三个包被条件，每组设三个平行。

1.2.5.5 封闭液优化 在选择最佳包被抗体量、酶标抗原稀释倍数、包被条件基础上，以1%脱脂乳粉、1% BSA、1%明胶为封闭液进行实验，每组设三个平行。

1.2.5.6 竞争时间优化 在选择最佳包被抗体量、酶标抗原稀释倍数、包被条件、封闭液基础上，设置45、60、120、150 min四个竞争时间进行实验，每组设三个平行。

以上各参数最佳值以RLUmax/IC50、半抑制浓度IC50为判断依据，RLUmax/IC50越大，IC50越小，则实验灵敏度越高。

1.2.6 dc-CLEIA方法学评估

1.2.6.1 dc-CLEIA标准曲线建立与灵敏度的测定 经过各参数优化，以抑制率为纵坐标，NPAMOZ log浓度为横坐标，绘制dc-CLEIA方法标准曲线，根据标准曲线计算该方法灵敏度IC50、线性范围和最低检测线IC10。

抑制率=（不添加标品孔RLU值-添加标品孔RLU值）/（不添加标品RLU值-空白孔RLU值）

1.2.6.2 精密度测定 以变异系数来反映方法精密度，取5个不同浓度的NPAMOZ标准品溶液进行dc-CLEIA分析，每个浓度做5个平行，分批进行3次实验，将得到RLU值进行批内和批间差异分析。

1.2.6.3 特异性测定 特异性以交叉反应率来反映，将呋喃它酮结构类似物呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、AHD、SEM、AOZ、NPAMOZ、NPAHD、NPSEM、NPAOZ分别配制成100、20、4、0.8、0.16、0.032 ng/mL系列浓度，作为酶标抗原竞争物，按dc-CLEIA检测步骤测定，求出各自结构类似物IC50值，计算交叉率CR：

CR（%）=IC50（NPAMOZ）/IC50（类似物）×100

1.2.6.4 准确性测定 准确性以加标回收率来反映，采用该方法对鸡肉样品AMOZ添加进行检测，每个添加浓度3个平行，计算样品AMOZ平均回收率。

样品前处理方法：50 g鸡胸肉均质，均质后称取2 g样品共4份，每份样品加9 mL超纯水，4份样品中分别加AMOZ标品，浓度分别为0、0.5、1.0、2.0 ng/g。搅拌均匀，每份样品加1 mL 1 mol/L HCl，200 μL 2-硝基苯甲醛，将处理好样品混合液置于37℃培养箱中振荡16 h。振荡后，每份混合液加10 mL 0.1 mol/L K2HPO4，0.8 mL 1 mol/L NaOH，10 mL乙酸乙酯，4500 r/min离心15 min，吸取乙酸乙酯上清液，氮气吹干，在吹干样品中加1 mL正己烷，晃荡30 s，加1 mL PBS，室温4500 r/min离心10 min，取下层溶液备用。

1.3 数据处理

数据采用Excel软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 AMOZ衍生物半抗原（CPAMOZ）鉴定

由表2和图1可知，有对醛基苯甲酸（4-CBA）与AMOZ连接的H存在，即表中④H存在，根据化学结构式，说明4-CBA与AMOZ连接成功，证明CPAMOZ成功合成。

表2 CPAMOZ氢谱分析结果Table 2 The 1HNMR analysis results of CPAMOZ

图1CPAMOZ结构式Fig.1 Chemical structure of CPAMOZ

图2 活化酯法酶标抗原CPAMOZ-HRP、CPAMOZ和HRP紫外扫谱图Fig.2 The activated ester method UV spectrum of CPAMOZ-HRP，CPAMOZ and HRP

2.2 酶标抗原合成鉴定

紫外图谱见图2。HRP载体蛋白最大紫外吸收峰在403 nm，半抗原CPAMOZ的最大紫外吸收峰在293 nm，CPAMOZ与HRP偶联后，CPAMOZ-HRP最大紫外吸收峰在289 nm和407 nm。CPAMOZ-HRP紫外吸收峰包括了CPAMOZ和HRP，并相对于CPAMOZ和HRP紫外吸收峰都发生了明显偏移，且吸收曲线也发生了明显变化，说明CPAMOZ-HRP偶联成功。

2.3 化学发光液的选择

表1中1～8组浓度比例不同的发光液组合的RLU值见图3。化学发光值越大，则检测灵敏度相对较好。从图3中看出，发光增强剂对碘苯酚（1～4组）比对甲苯酚（5～8组）的RLU值大，对碘苯酚（1～4组）的RLU值在50万以上，而对甲苯酚RLU值则保持在1万到2万间，故选择对碘苯酚为发光增强剂。在对碘苯酚作为增强剂前4组中，使用H2O2作为氧化剂1组和3组，随着时间推移，RLU值下降程度大，而使用过氧化氢脲作为氧化剂2组和4组，RLU值随着时间延长比较平缓，H2O2随着时间延长会自动分解，故选择过氧化氢脲作为氧化剂；2组比4组RLU值大，且6 min内第2组RLU值是增大的，故选择2组化学发光液组合即鲁米诺5 mmol/L、对碘苯酚7 mmol/L、过氧化氢脲3 mmol/L作为最佳组合。

图3 化学发光液的优化RLU值Fig.3 The optimization RLU of chemiluminescent solution

2.4 化学发光酶标板均一性

从表3中看出，化学发光板变异系数为2.52%，说明各孔间的均一性良好[24]。

2.5 包被抗体与酶标抗原稀释倍数确定

由表4可看出，随着抗体包被量减少或酶标抗原稀释倍数增大，B0值呈现下降趋势，根据棋盘法和B/B0，选择抗体稀释倍数为8000倍，酶标抗原稀释倍数为160倍，这时B/B0值最小，即方法灵敏度最高。

2.6 包被条件确定

从图4中看出，4℃过夜和37℃放置2 h后4℃过夜组IC50接近，且37℃放置2 h后4℃过夜组的RLUmax/ IC50大于其它两组，即此组灵敏度最好，能使抗体更好吸附于固相载体上，选择37℃放置2 h后4℃过夜组为最佳包被条件。

表3 化学发光板均一性数据Table 3 The homogeneity of chemical luminous plate

图4 不同包被条件对直接竞争法的影响Fig.4 The effect of different coating method for dc-CLEIA

2.7 封闭液确定

从图5看出，1%明胶组RLUmax/IC50明显大于1%脱脂乳粉组和1%BSA组，但在实验过程中发现，用明胶封闭完洗板，板底部明胶很难清洗干净，背景值大，故它的RLU值明显大于其他两组，IC50也大，比其他组大一个数量级，造成用明胶封闭的灵敏度降低；1%BSA的RLUmax/IC50大于1%脱脂乳粉，而两个组IC50接近，故选择1%BSA作为本实验最佳封闭液。

表4 直接竞争化学发光酶免疫法棋盘格数据Table 4 The checkerboard experiment data of dc-CLEIA

2.8 竞争时间确定

从图6可以看出，随着时间延长，IC50和RLUmax/IC50呈上升趋势，150 min时，IC50比其他三个时间下均大，IC50为方法学灵敏度，说明150 min时实验灵敏度降低程度大，选择150 min不适宜，60 min与120 min时的IC50接近，反应基本达到平衡，60 min时的RLUmax/ IC50值大，所以选择竞争时间为60 min。

图5 不同封闭液对直接竞争法的影响Fig.5 The effect of different blocking solution for dc-CLEIA

图6 竞争时间对直接竞争法的影响Fig.6 The effect of competitive time for de-CLEIA

2.9 标准曲线

根据优化后各参数，得到标准曲线见图7。线性方程为y=0.2499x－0.1976，根据曲线计算出IC50为0.62 ng/mL，最低检测限IC10为15.52 pg/mL，线性范围（IC20～IC80）为0.038～9.78 ng/mL。

图7 dcCLEIA标准曲线Fig.7 Standard curve of dcCLEIA

2.10 精密度测定

从表6看出，批内和批间变异系数均小于10%，表明建立dcCLEIA方法精密度较好[24]。

2.11 特异性测定

结果见表7。呋喃它酮原药IC50为78.2 ng/mL，CR为0.80%，除与呋喃它酮交叉外，与其他结构类似物交叉率均小于0.01%，说明该方法特异性良好。

表6 NPAMOZ化学发光酶免疫分析法的精密度Table 6 Precision of NPAMOZ dcCLEIA

表7 化学发光酶免疫分析法的特异性Table 7 The specificity of CLEIA

2.12 回收率测定

结果见表8。该方法检测AMOZ回收率在83%～94%之间，变异系数在4.24%～7.03%之间，说明该方法准确性良好。

表8 样品添加AMOZ回收率测定Table 8 Recoveries of AMOZ from different animal tissues

3 结论

本文建立了呋喃它酮代谢物AMOZ直接竞争化学发光酶免疫分析法，通过对各项参数优化，该方法IC50为0.62 ng/mL，检测限为15.52 pg/mL，其最低检测限低于国标[25]中液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测限0.5 μg/kg和我国出入境行业标准[26]中ELISA法检测限0.1 μg/kg，可以满足标准中对呋喃它酮代谢物限量要求。该方法特异性良好，除了与呋喃它酮原药有一定交叉外，与其他结构类似物无交叉，由于呋喃它酮原药在动物体内代谢迅速，故在实际样品检测中不会发生。通过对鸡肉样品中添加不同浓度的AMOZ，回收率（83%～94%）较好，为进一步检测AMOZ残留检测提供了便捷、准确的方法，也为下一步制备检测AMOZ残留化学发光酶免疫试剂盒提供了基础。

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Development of a direct competitive chemiluminescent enzyme immunoassay for detection of furaltadone metabolite

LV Yue-xia1，WANG Rui1，HUANG Deng-yu1，*，WANG Yun-gui2，LI Tao3
（1.School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Shenzhen Bioeasy Technology，Inc.，Shenzhen 518101，China；3.Shanxi Vanguard Technology Co.，Ltd.，Taiyuan 030006，China）

A direct competitive chemiluminescent enzyme immunoassay method（dc-CLEIA）for detection of AMOZ which based on lodine phenol enhancer Luminol-HRP-H2O2system was developed.The 3-amino-5-morpolinomethyl-2-oxazolidinone was metabolite of furaltdone.The sensitivity（IC50）and detection limit（LOD）of the method were 0.62 ng/mL and 15.52 pg/mL respectively.The linear range was 0.038～9.78 ng/mL.The relative standard deviations was below 10%.The antibody was high specific for furaltdone derivative and no cross-reactivity except the furaltdone original drug.The accuracy of the method was verified and the recovery in chicken tissues was 83%～94%.The method provided a convenient，accurate and rapid screening means for detecting AMOZ in actual animal tissue.

furaltdone metabolite；dc-CLEIA；chicken

TS207.3

A

1002-0306（2015）22-0071-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.006

2015－03－20

吕月霞（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品质量与安全，E-mail：yuexialv2008@163.com。

*通讯作者：黄登宇（1968-），男，博士，副教授，研究方向：食品质量与安全，食品新工艺与食品安全，E-mail：Huangdy110@126.com。