腰椎间盘突出患者组织MMP 及TIMP 指标的变化研究

王 涛，康 汇，李红川

（西安市红会医院，西安 710054）

腰椎间盘突出症是临床常见的疾病之一，主要是因为腰椎间盘各部分退行性改变后，在长期外力因素的作用下，椎间盘的纤维环破裂，髓核组织从破裂之处突出（或脱出）于后方或椎管内，导致相邻脊神经根遭受刺激或压迫，从而产生腰部疼痛，一侧下肢或双下肢麻木、疼痛等一系列临床症状［1］。其中椎间盘基质合成及分解失衡所致的基质成分紊乱是腰椎间盘突出主要表现，基质金属蛋白酶（MMPs）及基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）在调节椎间盘基质合成及分解中发挥着重要作用［2］。目前已有一些研究表明MMPs、TIMPs与腰椎间盘突出症的发生、发展有一定的关系［3-6］。本研究通过测定椎间盘组织中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2 的表达，重点关注了上述指标与腰椎间盘突出的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料实验组：选取2013 年1 月～2014 年12 月期间在我院骨科住院手术的腰椎间盘突出症患者的椎间盘组织标本50 例，取材部位为L3～S1椎间盘组织，年龄在25～60 岁之间，其中游离型15 例、脱出型17 例、突出型18 例。

对照组：选取同时期因创伤所致腰椎骨折而来我院行腰椎骨切除的椎间盘组织标本10 例，对照组患者在发生创伤前均无腰腿疼痛病史，取材部位与年龄与实验组一致。

1.2 标本采集及处理取椎间盘组织标本，生理盐水冲洗3 遍，去除表面血液，分离纤维环与髓核组织，置于10%中性甲醛中固定48h，常规脱水石蜡包埋，连续切片厚 4、5μm。

1.3 检验方法取每一份椎间盘组织标本，一片HE染色用于病理诊断，一片用做阴性对照，另取7 片分别用于MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14、TIMP-1、TIMP-2 免疫组化染色。

免疫组化染色：1）石蜡切片于60 ℃孵箱中加热1 h；2）二甲苯脱蜡10 min×3 次；3）无水乙醇1 min×2 次；3）3%H2O2 室温孵育10 min，消除内源性过氧化物酶的活性；4）PBS 洗1 min×3 次；5）抗原修复；6）10%山羊血清封闭2 h；7）一抗（1：100）4℃孵育过夜；8）PBS 洗1 min×3 次；9）二抗室温孵育2 h；10）PBS 洗1 min×3 次；11）DAB 显色；12）自来水洗1 min；13）苏木精染色5 min；14）自来水洗1 min×3 次；15）70%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯，每步5 min，脱水脱脂透明；16）中性树胶封片。光镜下拍照。

1.4 结果判定MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 阳性染色为胞浆染色，镜下表现为髓核细胞和软骨细胞的胞浆中见棕黄色颗粒判断为阳性。MMP-13 定位于髓核细胞和软骨细胞的胞浆或胞膜，阳性染色镜下表现为髓核细胞和软骨细胞的胞浆或胞膜出现黄染判断为阳性。

免疫组化结果采用定量分析法，每张切片随机选择10 个高倍视野，对髓核细胞

及阳性细胞进行计数测定，计算阳性细胞表达率=10 个视野总的髓核细胞染色阳性数/10 个视野总的髓核细胞数×100%。

1.5 统计学处理应用SPSS 17.0 软件包对MMPs、TIMPs 表达数据进行显著性检验及相关性分析。组间相关性分析根据LSD 多重比较方法进行检验，P<0.05判断为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMPs 在腰椎间盘突出患者髓核中的表达MMPs 在腰椎间盘突出患者髓核中的表达高于对照组，而且不同退变程度的表达也不同，随着病情的加重MMPs 的表达率也显著增高，统计学分析均有显著差异（P<0.05）。结果见表1。

表1 MMPs在腰椎间盘突出患者髓核中的表达

2.2 MMPs 在腰椎间盘突出患者纤维环中的表达MMPs 在腰椎间盘突出患者纤维环中的表达也高于对照组，而且随着病情的加重MMPs 的表达率也显著增高，统计学分析均有显著差异（P<0.05）。结果见表2。

表2 MMPs在腰椎间盘突出患者纤维环中的表达

2.3 TIMPs 在腰椎间盘突出患者髓核和纤维环中的表达TIMPs 在腰椎间盘突出患者髓核和纤维环中的表达同样高于对照组，随着病情的加重表达率也呈现了一定程度的上升，统计学分析均有显著差异（P<0.05）。结果见表3。

表3 TIMPs在腰椎间盘突出患者髓核和纤维环中的表达

3 讨论

椎间盘的细胞外基质由蛋白多糖、胶原和水等主要构成，其中胶原对椎间盘的生理功能具有重要影响。当椎间盘发生退变时组织学表现为胶原减少、断裂以及细胞的凋亡。而MMPs 的过量表达及椎间盘细胞活性的降低所导致的细胞外基质合成与降解失衡是造成椎间盘退变的直接原因［7］。MMPs 一组需要Zn2+、Ca2+等金属离子作为辅助因子的同工酶，其来源于多种类型的细胞，对细胞外基质有广泛的降解作用，与椎间盘退行性改变、肿瘤的浸润及转移、关节炎、肾小球肾炎、腹膜炎、组织溃疡、皮肤烧伤等疾病和正常组织的更新、吸收有密切的关系［8］。一般情况下MMPs 与TIMPs的表达保持着一种相对的动态平衡状态，当腰椎间盘发生退变后，MMPs 活性异常增高，MMPs 与TIMPs 的平衡被打破，导致细胞外基质被降解，随后椎间盘的水分和固有弹性丧失，导致腰椎间盘突出的发生，最终椎间盘生物力学功能的减退。

MMPs 具有一定的底物特异性，自1962 年被首次发现以来，人体内的MMPs 家族已分离鉴别出28 个成员，按其发现的先后顺序，分别命名为MMP-1～28。本次研究对MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13等5 个MMPs 展开了检测。其中MMP-1、MMP-13 为胶原酶，主要水解的底物是纤维类胶原；MMP-2、MMP-9为明胶酶，主要水解的底物为变性胶原，可以分解糖蛋白、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白等；MMP-3 为基质溶解酶，他的水解底物比较广泛，如Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原、明胶、蛋白聚糖以及糖蛋白等［6，8-10］。TIMPs 是一种内源性的基质金属蛋白酶组织特异性抑制剂，迄今发现的 TIMP 家庭有4 种，即 TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4，不同的 TIMPs 与不同的MMPs 具有选择性的亲和力［11，12］。

椎间盘由髓核、纤维环和软骨终板三部分组成，本次研究重点关注了髓核、纤维环中MMPs 与TIMPs 的表达。研究结果显示腰椎间盘突出患者髓核和纤维环中MMPs 与TIMPs 均呈现了不同程度的升高，而且随着病情的加重，这些指标会随之上升。我们认为在椎间盘组织中，MMPs 与TIMPs 可能处于一种动态平衡关系，随着退变的椎间盘中MMPs 表达的增加，TIMPs 的表达反馈性增加，抑制MMPs 对椎间盘基质的降解，从而延缓椎间盘退变。但随着MMPs 的表达不断增加，TIMPs失代偿，打破了两者平衡，TIMPs 抑制作用减弱，导致椎间盘退变的发展。综上所述，MMPs、TIMPs 表达失衡可能是基质降解导致腰椎间盘突出发生的重要原因，但本研究样本量较小且仅采用了免疫组化来研究对实验结果的可靠性有一定影响，有关方面的问题我们会展开进一步的深入研究。

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