基因工程抗癌药物CNB 通过线粒体途径促进细胞凋亡的研究

魏佳苡，魏 群，陈 静，杨 扬

(1.香港中文大学，香港 999057；2.北京师范大学生命科学学院 北京 100000；3.川北医学院附属医院，南充 637000；4.北京师范大学生命科学学院 北京 100000)

钙调蛋白磷酸酶B 亚基（Calcineurin subunit B，CNB）是钙调蛋白磷酸酶（Calcineurin，CN）的调节亚基。正常生理状态下，CNB 不仅存在于细胞内，也存在于胞外，如血清中［1］。研究发现，CNB 除了作为钙调蛋白磷酸酶A 亚基（Calcineurin subunit A，CnA）的调节亚基外，还有其单独的功能［2］。对CNB 药效的一系列研究发现，CNB 具有抑制肿瘤细胞生长的功能［3］。而线粒体是在细胞凋亡、信号转导中起关键调节作用的细胞器，故研究CNB 对线粒体凋亡途径的影响极为重要［4］。本研究本研究采用MTT 比色法检测细胞存活和生长、流式检测细胞凋亡测定CNB 对肿瘤细胞的杀伤效果；采用高内涵分析与成像仪检测细胞线粒体膜电势，旨在探讨基因工程药物CNB 通过线粒体途径引起肿瘤细胞凋亡的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂pc3.1-CNB 质粒 、大肠杆菌菌株 、HepG2 细胞、Sk-hep1 细胞均为本室保存。蛋白预染Marker，立陶宛MBI Fermentas 公司；Anti-Calcineurin B，本实验室制备；Anti-ß-actin，美国Santa Cruz 公司；HRP-羊抗兔二抗、HRP-羊抗鼠二抗，北京中杉金桥公司；Purified RNA extracted kit，百泰克公司；DTT，百泰克公司；DTT，德国Merck 公司；NP-40，美国Sigma公司；质粒提取试剂盒，百泰克公司；胰蛋白酶，迈晨生物科技公司；rhCNB，本实验制备；dNTP、MLV-反转录酶、OligdT 、RNA 酶抑制剂，TAKARA 公司；Lipofectamine TM 2000，美国Invitrogen 公司。

1.2 仪器设备恒温CO2 培养箱，德国HERA 公司；Coic 倒置显微镜，重庆光电仪器有限公司；酶标仪，美国Bio-Rad 公司；实时定量PCR 仪7500，ABI；恒温CO2 培养箱，德国HERA 公司；酸度计520A，美国ORION 公司。

1.3 实验方法细胞培养；细胞传代；M T T 检测；C C K 8 细胞活性检测；流式细胞检测；免疫印迹；实时荧光定量P C R 实时定量P C R：引物合成序列，Primer sequences（5′-3′）：Bid，5' ACCCTAGAGACATGGAGAAG 3’（forward），5' AGCTATCTTCCAGCCTGTCT 3'（reverse）；Bak，5’ AGAGCTGTCTGAACTCACGT 3’（forward），5’TTACACTGTGCCAGAGCCAT 3’（forward）；Bim，5’ GAGAAGGTAGACAATTGCAG 3’（forward），5’ GACAATGTAACGTAACAGTCG 3’（forward）；Bcl-2，5’ CTTTAGTACAGCGGGTCA 3’（forward），5’ CTTTAGTACAGCGGGTCA 3’（forward）；Bcl-xl，5’ TCCCAGAAAGGATACAGCTGG 3’（forward），5’ACTGAAGAGTGAGCCCAGCAG 3’（forward）；质粒提取；细胞转染（瞬转）；JC-1 染色检测细胞线粒体膜电势。

2 结果

2.1 CNB 有效抑制肿瘤细胞增殖由图1，我们可以看出，在体外CNB 能够有效的抑制HepG2 细胞的增殖。CNB 对HepG2 细胞的抑制具有浓度依赖效应，浓度越高，抑制率相对越高。MTT 实验证明，在体外CNB能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，这与动物实验结果是一致的。并且，CNB 对正常细胞的增殖基本无影响。

2.2 不同批次CNB 均能够抑制肿瘤细胞增殖由图2可知，不同批次的CNB 均具有同样的作用，能够抑制肿瘤细胞的增殖。但不同批次的CNB 效果不同。因此，我们在进行下面的研究时，选择了药效较高批次的CNB。

图1 MTT检测结果

图2 CCK8检测结果

2.3 CNB 能上调细胞后期凋亡比例实验结果表明

CNB 有浓度梯度效应，随着CNB 浓度增加，能明显上调肿瘤细胞晚期凋亡的比例，当浓度达到700ug/ml 时和抗肿瘤药品五氟尿嘧啶效果基本相同，说明CNB 能促进肿瘤细胞凋亡（图3）。

2.4 在不同细胞系中CNB 均能上调Caspase3 的表达

实验用western blotting 检测Caspase 全长蛋白，结果表明3 种细胞加入CNB 后均Caspase3 表现为下调，说明Caspase3 剪切体上调，Caspase3 蛋白被激活，显示CNB 能促进细胞凋亡（图4）。

图3 Annexin V/PI法检测细胞凋亡

图4 加入CNB后3种不同细胞系Caspase3免疫印迹结果

2.5 CNB 引起细胞线粒体膜电势降低通过对CNB对线粒体膜电势的影响的检测，我们发现CNB 可以显著减低线粒体膜电势，因此说明线粒体膜电势的降低是CNB 促进诱导的细胞凋亡的一个步骤。而且线粒体电势的降低有浓度依赖性，随着CNB 的浓度增加，线粒体电势下降更加明显。该结果与本实验室前期结果一致，CNB 能够定位到线粒体，导致线粒体膜通透性增加，从而引发线粒体介导的凋亡。见图5。

图5 .1 加入不同浓度CNB后Sk-hep1细胞线粒体膜电势情况

图5 .2 加入不同浓度CNB后HepG2细胞线粒体膜电势情况

3 讨论

细胞凋亡是程序性死亡的一种主要形式［5］。线粒体介导的细胞凋亡途径是细胞凋亡通路中的重要一条［6］。线粒体细胞凋亡通路中关键的是细胞色素c 的释放。当线粒体膜通透性升高时，细胞色素c 能够被释放，进入到胞浆中［7-8］。细胞色素c 的释放有两种途径。一种是PTP（膜通透转运孔）复合体，由线粒体的外膜蛋白聚合而成［9］。线粒体接收到外界的刺激以后，使得PTP 开放、线粒体膜电位消失，线粒体的外膜裂开，细胞色素c和AIF（凋亡诱导因子）释放。另一种是Bcl-2 家族蛋白形成的通道。Bcl-2 家族可分为抗凋亡和促凋亡两类。其中Bcl-2 的功能是抗凋亡，而Bax 则是促进细胞凋亡。两者在线粒体上控制细胞色素c 的释放。正常状况下，Bcl-2 是以同源二聚体的形式存在，具有抗凋亡的作用。当Bax 与Bcl-XL 或Bcl-2 形成异源二聚体时，这些分子的抗凋亡作用就丧失。Bax 能够构成跨线粒体外膜的孔道，使线粒体膜电位降低，促进细胞色素c 和AIF 的释放，细胞色素c 与凋亡酶激活因子1（Apaf-1）、ATP 及pro-Caspase9 形成凋亡复合体，通过pro-Caspase9 的自身酶切活化，激活Caspase9，进一步活化Caspase3，引起细胞凋亡［9-10］。本研究重点探讨基因工程药物CNB 通过线粒体途径引起肿瘤细胞凋亡的机制。

本实验室之前的研究结果显示CNB 对荷瘤小鼠有抗癌的功效。为揭示这一功效的分子水平的作用机理，我们采用MTT 比色法和CCK-8 试剂盒来检测细胞存活和生长。通过实验验证，CNB 对HepG2 细胞和Skhep1 细胞（肿瘤细胞）的增殖均有较为显著的抑制效果，而对正常细胞293t 无明显影响，且不同批次CNB 实验效果有稍许差异。为了探究进一步探究CNB 对HepG2细胞和Sk-hep1 细胞的杀伤作用，我们采用流式细胞术对药物处理细胞进行测定，发现CNB 处理后细胞处于凋亡晚期的比例明显上升。而对凋亡经典标志性蛋白Caspase3 的免疫印迹实验显示了加药处理的细胞中Caspase3 被活化，验证了CNB 能促进肿瘤细胞凋亡的事实。同时，经CNB 处理后的细胞线粒体膜电势呈下降趋势，并且有浓度梯度效应，证明了CNB 能够通过线粒体途径促进细胞凋亡。

需要指出的是，对CNB 的作用机理的研究仍处于初级阶段，CNB 对细胞的刺激绝对不局限在这一条通路上，不同细胞可能有不同表现。机体对刺激的应答是细胞内各种信号通路相互协同作用的结果，通过各信号的精细调节，达到机体内环境的动态平衡。

由于Bcl-2 和Bcl-xl 存在于线粒体膜上，而CNB也能定位到线粒体上，所以本实验之后的探索研究可以从通过CoIP 实验验证CNB 与Bcl-2 和Bcl-xl 直接结合起作用来促进线粒体途径的细胞凋亡这个方向入手。

CNB 能够抑制肿瘤细胞增殖；CNB 能够促进肿瘤细胞凋亡；CNB 可促进线粒体途径的细胞凋亡。

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