壳聚糖负载TGF-β1 基因修饰骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

周少怀，范明宇，方红育，李宏亮

（武汉市第三医院，武汉 430060）

关节软骨创伤性缺损及退行性变是目前困扰国内外学者的重大难题，临床上修复关节软骨缺损的常用方法存在不同程度的缺陷［1］。近些年来，组织工程学技术越来越广泛地应用于软骨缺损的修复，其主要是以种子细胞和生物降解聚合物移植来保持、改善和修复组织功能为特征新建组织工程软骨的新方法。本研究以壳聚糖作为组织工程负荷载体经过基因修饰扩增原代培养的BM-MSCs，将构成的细胞-支架复合物直接植入兔关节软骨缺损处，观察其成软骨的病理形态及软骨基质的蛋白表达变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物15 只新西兰大白兔购自北京维通利华实验动物中心，1.5 月龄，体重（1±0.1）kg。

1.1.2 主要试剂DMEM、胎牛血清、无血清培养基Opti-MEM 购自Hyclone 公司；Lipofectimane 2000 购自Sigma 公司；壳聚糖购自ALVITO Biotechnology GmbH公司；鼠抗TGF-β1、Ⅱ型胶原多克隆抗体购自Abcam公司；鼠抗CD44、CD34、CD45、Laminin 多克隆抗体购自Santa 公司。

1.2 BM-MSCs 的分离培养与鉴定［1］抽取新西兰大白兔骨髓5 mL，混合肝素溶液1 mL（2×104U/ L）抗凝，室温下以1000 r/ min 离心5min，去除上清液；DMEM重悬、洗涤细胞，同样条件下离心、弃上清液；10%FCS-DMEM 重悬细胞，接种于培养瓶中，加入含有双抗的10% FCS-DMEM 培养液（青霉素G 105U/ L，链霉素100mg / L），37 ℃、5% CO2 培养箱中培养。 3 d 后首次换液，去除未贴壁细胞，此后每3 d 换液1 次。PBS冲洗BM-MSCs 爬片3 次，4%多聚甲醛PBS 室温固定15 min；滴加鼠抗兔CD44（1：100）、CD34（1：100）、CD45（1：100）、Laminin（1：100）多克隆抗体，37 ℃温箱中作用1 h；PBS 洗涤3 次，避光下滴加马抗鼠荧光标记二抗（1：100），于湿盒中37°C 孵育1 h；PBS 洗涤3 次，激光共聚焦显微镜下观察，用合适波段激发，采集图像。

1.3 T G F-β1 基因修饰B M-M S C s取1×106BM-MSCs 接种于24 孔板中，当细胞融合达到80%～90%%进行基因转染。转染液的配制：①为20 μL 真核表达质粒pcDNA3- TGF-β1（浓度0.36μg/μL）加入600 μLOpti-MEM 中；②160 μL Lipofectimane 2000 加入600 μLOpti-MEM 中；③将前两步骤中的液体混匀，室温下静置1 h。200μL 10% FCS-DMEM 培养液加入24 孔板中，再缓慢滴加转染液200 μL，边滴加边晃动，37 ℃、5% CO2 培养24 h。48 h 后改用10%FCS-DMEM 培养液进行筛选培养，此培养液中含有500 μg/mLG418。28 d 后出现阳性克隆，将其挑至培养皿中继续培养，此时培养液改用含400 μg/mL G418 的10% FCS-DMEM，后转移至25 mL 培养瓶中培养待用。

1.7 统计学处理采用SPSS15.0 统计软件分析实验数据，剂量资料均采用表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 BM-MSCs 鉴定原代培养第3 d 可见长梭形细胞贴壁生长，出现细胞集落；1 w 后多数细胞体积变大，胞浆有突起，核居中；2 w 后细胞达到80%～90%融合（图1）；经过多次传代，细胞形态保持均匀一致；免疫荧光结果显示，CD34、CD45、Laminin 抗原表达阴性，而CD44 抗原表达呈强阳性（图2）。

图1 原代BM-MSCs培养2周（倒置相差显微镜×40）

图2 原代BM-MSCs CD44表达（激光共聚焦显微镜×200）

1.4 壳聚糖负载BM-MSCs 修复关节缺损壳聚糖（厚0.5 cm，直径1.5 cm，圆柱形）置于6 孔板内，培养基清洗3 次；用无菌注射器分别将BM-MSCs、TGF-β1 基因修饰的BM-MSCs 细胞悬液滴加在壳聚糖表面的陷窝中（每块壳聚糖加入细胞量为1×106/mL），每孔加入20 mL10%FCS-DMEM 培养液，37 ℃、5% CO2 培养48 h。

15 只新西兰大白兔随机分为壳聚糖修复组（1 组）、壳聚糖+BM-MSCs 修复组（2 组）、壳聚糖+ TGF-β1-BM-MSCs 修复组（3 组）；无菌环境下切开兔膝关节内侧，暴露出双侧膝关节面，于一侧膝关节股骨内侧髁负重区髌骨沟用手钻（直径5 mm 钻头）缓慢钻出全层关节软骨缺损（深度3 mm），对侧膝关节作对照［2］。仔细修复关节囊后，逐层缝合。术后分笼喂养，不限制其活动，未进行抗炎治疗。

1.5 病理学观察术后4 w、24 w，麻醉后处死兔子，解剖双侧膝关节，分离邻近脂肪、肌肉后进行病理学大体观察；将股骨远端固定于10%多聚甲醛24 h，后浸泡于15%中性乙二胺四乙酸（EDTA）中脱钙1 w，脱水、透明、透蜡、石蜡包埋、切片，行甲苯胺蓝染色，封固、观察。

1.6 蛋白质印迹术后24 w，将股骨远端软骨缺损修复部分取出，切碎研磨，加入RIPA 细胞裂解液，提取总蛋白，制10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳，转膜，封闭一抗工作液（TGF-β1 1∶1000；Ⅱ型胶原1∶1000），4℃隔夜，室温孵育二抗工作液（1∶3000）2 h，ECL 发光，借助BIO-RAD 分子成像仪激发荧光和采集目的条带，借助Image J 分析软件定量分析目的条带。

2.2 病理学大体观察关节软骨修复情况术后4 w，1组关修复侧关节软骨缺损区被褐色纤维样组织覆盖，缺损加深、加大；2 组有光滑、淡粉色与软骨形态相近的组织覆盖，缺损略变浅；3 组有光滑、乳白色组织透明软骨样组织覆盖，缺损几乎消失。术后24 周，1 组缺损内只要由纤维组织和少量颗粒状软骨组织填充，缺损非常明显；2 组缺损几乎被新生透明软骨组织修复，但薄厚不均；3 组缺损完全被光滑的透明软骨组织覆盖、填充，与邻近透明软骨组织无差别。

2.3 病理组织学观察甲苯胺蓝染色情况术后24 w，1 组软骨缺损部位无甲苯胺蓝着色，以纤维组织修复为主，缺损扩大；2 组与正常软骨衔接部有明显的甲苯胺蓝着色，软骨细胞样细胞较多，胶原排列紊乱，缺损中央有较多软骨细胞，但无正常有序的排列，薄厚不均；3 组缺损区甲苯胺蓝着色较深且均匀，与周围正常软骨组织衔接紧密，中央有大量软骨细胞，排列有序，薄厚均匀一致。

2.4 TGF-β1 蛋白表达的鉴定3 组TGF-β1 蛋白表达明显高于1 组和2 组（P<0.05）（图3，表1），说明TGF-β1 基因修饰成功，pcDNA3- TGF-β1 质粒已成功转染入BM-MSCs 中。

图3 蛋白质印迹法检测各组TGF-β1蛋白表达

2.5 蛋白质印迹法检测各组Ⅱ型胶原的蛋白表达3组Ⅱ型胶原蛋白表达明显高于1 组和2 组（P<0.05），而1、2 组之间无显著性差异（P>0.05）（图4，表1）。

图4 蛋白质印迹法检测各组Ⅱ型胶原蛋白表达

表1 术后24周各组软骨缺损修复组织TGF-β1和Ⅱ型胶原蛋白表达

表1 术后24周各组软骨缺损修复组织TGF-β1和Ⅱ型胶原蛋白表达

与3组相比，*P<0.05

组别 样本数 TGF-β1 Ⅱ型胶原1组（壳聚糖修复组）5 0.891±0.043*1.037±0.023*2组（壳聚糖+BM-MSCs修复组）5 1.102±0.102*1.118±0.074*3组（壳聚糖+ TGF-β1-BM-MSCs修复组）52.584±0.0982.490±0.111

3 讨论

关节软骨属于特殊的结缔组织，覆盖在关节的承重面上，由软骨细胞及软骨基质构成，软骨细胞可以合成、分泌软骨基质（如Ⅱ型胶原），这种分泌具有高度特异性。软骨本身无血管、淋巴管、神经，软骨细胞不能继续分化，软骨细胞在软骨陷窝内故迁移受限，滑膜细胞数量少、生物活性低，因此，软骨病变修复能力低下，会持续造成关节软骨退变，造成关节软骨损伤［4］。

骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）增殖能力强、分化能力多向、免疫原性低，以BM-MSCs 为种子细胞构建组织工程软骨成为临床治疗创伤性软骨缺损的新手段。关节软骨缺损修复过程主要由BM-MSCs 通过各种生长因子占主导的诱导分化形成软骨细胞而完成。TGF-β1 能诱导BM-MSCs 向软骨细胞分化［5，6］，但外源性TGF-β1 作用短暂、易于丢失、价格昂贵；若将TGF-β1 基因转染BM-MSCs，通过高表达的TGF-β1 诱导BM-MSCs 向软骨细胞分化，以此基因修饰的BM-MSCs 作为种子细胞的组织工程学技术具有重大的临床意义。

本实验通过骨髓原代培养分离BM-MSCs，免疫细胞荧光显示CD34、CD45、Laminin 抗原表达阴性，而CD44 抗原表达呈强阳性，进一步证实分离细胞为BMMSCs。通过质粒转染BM-MSCs 扩增TGF-β1 基因，诱导BM-MSCs 向软骨细胞分化。壳聚糖具有较好的凝胶黏附性，与层黏连蛋白、纤维连接蛋白紧密亲和，为细胞生长、分化、新陈代谢提供立体支架。本实验应用壳聚糖负载BM-MSCs，填充到兔的骨关节全层软骨缺损处，观察发现其能与缺损处紧密附着。本研究在不限制兔自由活动的前提下进行，术后兔可做适当运动。术后4 w，各组的壳聚糖大部分被吸收，修复区域未见炎症反应，证实在软骨组织工程中壳聚糖可作为合适的细胞外支架。

霍建忠等［2，3］研究壳聚糖复合TGF-β1 基因质粒扩增修饰BM-MSCs 修复兔关节软骨缺损的短期变化，TGF-β1 在术后6 w 仍可检测到，12 w 后软骨缺损几乎被透明软骨组织填充，结构与正常软骨相似。本实验主要侧重观察关节软骨缺损修复的远期变化，术后24 w缺损区域完全被光滑、透明软骨组织填充，与邻近透明软骨组织无差异，证实该修复方法稳定可靠；术后24 w壳聚糖负载TGF-β 1-BM-MSCs 修复组仍可见TGF-β1 高表达，基因修饰技术将TGF-β1 导入BM-MSCs中，文献报道［7］TGF-β1 只维持短期高表达，本结果显示TGF-β1 质粒转染BM-MSCs 可维持TGF-β1 长期高表达，说明经过基因修饰的BM-MSCs 是非常合适的软骨组织工程种子细胞；II 型胶原是软骨细胞特异性细胞外基质，是BM-MSCs 向软骨细胞分化的重要证据，本实验显示术后24 w 壳聚糖负载TGF-β1-BM-MSCs修复组II 型胶原的表达远高于其他两组，说明缺损区域被BM-MSCs 分化的软骨细胞和其分泌的软骨基质大量覆盖修复。

本研究通过动物实验，证实壳聚糖负载TGF-β1基因修饰的BM-MSCs 构建组织工程软骨修复关节软骨缺损的效果显著优于单纯以壳聚糖或壳聚糖负载未基因修饰的BM-MSCs，该方法构建的组织工程软骨具有修复周期短、远期疗效好、明显改善软骨细胞的黏附能力等优点。

［1］ 孙迎放.骨与关节损伤修复的研究进展［J］.中华损伤与修复杂志(电子版), 2014, 9(5): 478-481.

［2］ 霍建忠, 蒋淳, 郭常安, 等.转化生长因子-β1基因修饰对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响［J］.中华手外科杂志, 2005,21(4): 245-248.

［3］ 霍建忠, 陈峥嵘, 蒋淳, 等.转化生长因子-β1基因修饰骨髓间充质干细胞复合壳聚糖修复兔关节软骨缺损［J］.中华风湿病学杂志,2005, 9(7): 393-396.

［4］ 王亦璁.骨与关节损伤［M］(第4版).北京: 人民卫生出版社, 2009:384-385.

［5］ Lim JJ, Temenoff JS.The effect of desulfation of chondroitin sulfate on interactions with positively charged growth factors and upregulation of cartilaginous markers in encapsulated MSCs［J］.Biomaterials, 2013,34(21): 5007-5018.

［6］ Qi BW, Yu Ax, Zhu SB, et al.Chitosan/poly(vinyl alcohol) hydrogel combined with Ad-hTGF-β1 transfected mesenchymal stem cells to repair rabbit articular cartilage defects ［J］.Exp Biol Med, 2013, 238(1):23-30.

［7］ 洪洋, 霍建忠, 郭常安, 等.骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的实验研究［J］.中国临床医学, 2013, 20(4):457-461.