吗啡暴露对猫神经元线粒体超微结构的影响

封小强　梁传栋　郭非　郭韬

吗啡暴露对猫神经元线粒体超微结构的影响

封小强梁传栋郭非郭韬

【摘要】目的观察吗啡暴露对猫脑神经元线粒体超微结构的影响，为吗啡暴露造成的神经毒性和脑功能受损机制研究提供支持。方法将12只家猫随机分成对照组(n=3)、吗啡暴露组(n=9)。吗啡暴露组行盐酸吗啡猫背部皮下注射，用吗啡剂量递增法，连续给药5 d。对照组则在对应时间、对应部位注射相同体积的0.9%氯化钠溶液。观察吗啡暴露组与对照组猫脑神经元线粒体超微结构的变化。结果吗啡暴露组猫脑神经元线粒体超微结构在数量、形态、内部膜结构、基质内包涵体各方面发生改变，对应吗啡损害不同时期，呈现多样变化。结论吗啡造成的线粒体超微结构损伤，可作为脑细胞能量代谢功能障碍并最终导致各项脑功能活动紊乱的始发机制。

【关键词】吗啡;线粒体;超微结构

作者单位: 050400河北省平山县人民医院肿瘤科(封小强) ;河北省人民医院功能神经外科(梁传栋、郭韬) ;河北医科大学第二医院康复科(郭非)

E-mail: 8888guotao@ sina.com

吗啡滥用成瘾，戒断反应严重，并且复吸率高。解决吗啡类药物的成瘾、戒除不仅是迫切的社会问题，也对现代神经生物学、病理学、毒理学提出挑战。在本课题系列中，我们已研究并报道了吗啡成瘾猫模型的建立及脑电图、神经病理学特点。本实验在此基础上，进一步观察吗啡暴露对猫脑神经元线粒体超微结构的影响，并进行病理变化的生理、生化层面的对照分析，为吗啡暴露造成的神经毒害和脑功能受损的机制研究提供支持。

1　材料与方法

1.1实验动物成年健康雄性家猫12只(河北省人民医院临床提供)，体重2～3 kg。其中吗啡暴露组9只，对照组3只。

1.2实验药品沈阳第一制药厂生产的盐酸吗啡注射液。国药准字: H21022436，麻醉药品和精神药品生产定点批件号: TD2006-0028。康哲(湖南)制药有限公司生产的盐酸纳络酮往射液。批准文号:国药准字H20033435，产品批号20070113。

1.3吗啡成瘾猫模型(1)吗啡暴露组猫分别于每日8∶00、12∶00、16∶00行盐酸吗啡背部皮下注射。按剂量逐日递增原则，连续给药5 d。对照组猫在对应时间、对应部位注射相同体积的0.9%氯化钠溶液。(2)给药剂量:第1天吗啡单次用量2.5 mg/kg，第2天5 mg/kg，第3天7.5 mg/kg，第4天10 mg/kg，第5天12.5 mg/kg，严格按时、按次注射。(3)戒断诱发实验:第6天8∶00实验组以0.5 mg/kg纳洛酮诱发戒断症状。依照Maldonado等［1］的戒断症状评分标准，评定戒断症状。对照组给予相同程序的等体积0.9%氯化钠溶液皮下注射。通过评定猫的戒断症状，以判定吗啡成瘾猫模型是否建立成功。详细过程参见文献［2］。

1.4病理学检查2组实验猫分别于造模成功后3周行脑组织取材。先将猫用3%戊巴比妥以1 ml/kg腹腔注射麻醉。之后剪开胸前壁，暴露心脏，经升主动脉先灌入0.9%氯化钠溶液250 ml，然后用含4%多聚甲醛的PBS液灌注。待猫躯体僵硬后开颅，分别取额、颞、顶、枕叶皮质组织。将组织切成1 mm3左右小块，2.5%戊二醛固定。制成超薄切片，JEM-1230(JEOL Electron Microscope，Japan)透射电镜下观察照相。拍摄含细胞核的正常猫脑神经元和吗啡暴露猫神经元各60个图像，分别作为对照组和实验组观察分析。

2　结果

2.1实验组电镜下吗啡暴露猫皮质神经元大多呈凋亡状态，神经元胞体内，胞浆胞核电子密度增加，内质网肿胀扩张、线粒体肿胀、空泡样变性。亦可见神经元变性坏死，表现为线粒体瘠消失，粗面内质网扩张，细胞器减少，排列混乱，核周间隙扩张，核膜模糊不清，染色质边集。各部位猫脑神经元超微病理学改变类型、病变程度相同。见图1。

图1　神经元凋亡。核电子密度增加，核周隙扩张(TEM×5 K)

2.2吗啡暴露猫神经细胞线粒体超微结构的变化包括数量、形态、结构的改变及包涵物的形成，可能代表了吗啡损害不同时期的线粒体。

2.2.1数量:多数神经元线粒体数量明显增多，且分布不均匀。部分显示线粒体数量减少或变化不明显。见图2。

2.2.2形态:线粒体有明显的形态改变，弥漫肿胀呈球形甚至不规则形，并可见线粒体互相融合而成的巨大线粒体。少数出现线粒体体积变小，内腔皱缩，嵴萎缩，基质电子密度增高。见图3。

图2　神经元内线粒体增多、肿胀，内质网、高尔基体扩张(TEM×10 K)

图3　线粒体肿胀，可见线粒体互相融合成巨大线粒体(TEM×6K)

2.2.3结构:多数线粒体嵴结构模糊，排列紊乱，有的呈同心圆样排列，线粒体基质电子密度明显降低。少数线粒体发生退变，表现为双层膜间隙不清，可呈多囊状，部分中央区空泡化。甚至其内充满电子致密物或双层膜消失，外膜断裂、内部结构溶解，只残留有一层膜性结构，呈空泡样改变，仅存残迹。见图4。

图4　线粒体嵴结构模糊，排列紊乱，基质电子密度明显降低(TEM×10 K)

2.2.4包涵体:基质内可见类糖原颗粒、结晶状包涵体，部分可观察到小泡样包涵体。见图5。

图5　线粒体局部肿胀变形、稀少，内见结晶状包涵体(TEM×12 K)

2.3对照组对照组猫的电镜显示脑组织神经元细胞核电子密度均匀，细胞核核膜无皱缩，染色质密度正常。细胞质内粗面内质网形态正常，线粒体嵴清晰，排列整齐，其他细胞器丰富。未见实验组上述改变。见图6。

图6　对照组脑组织细胞核、细胞质、细胞器结构完整，排列整齐(TEM ×6 K)

3　讨论

吗啡对中枢神经有严重的毒性损伤，但损害作用机制仍不明确。线粒体是生成三磷酸腺苷(ATP)的场所，是真核细胞内最重要的细胞器之一，对细胞的正常生命活动发挥重要作用。神经细胞内、外环境条件的异常，均可引起线粒体结构和功能改变，造成能量供应障碍，导致其他细胞器及整个细胞的损害。脑细胞活动的能源供应不足必将会造成脑神经中枢各项功能活动衰减。所以线粒体变化可作为吗啡暴露造成的神经毒性和脑功能受损的评判指标［3］。

本组实验结果显示，吗啡暴露猫神经元线粒体超微结构变化明显。首先是数量的变化。病理学认为，线粒体增生分为真性增生和假性增生，真性增生是线粒体膜成分与线粒体氧化酶成比例的增生;假性增生是指线粒体膜成分增生而线粒体氧化酶无改变或改变不明显［4］。结合本组实验结果及文献我们认为，吗啡通过血脑屏障，作用于线粒体这个对毒物敏感的细胞器，与线粒体氧化呼吸链传递复合体中含巯基的酶结合，使这些酶活力受到抑制，呼吸链电子传递氧化过程受阻，氧化磷酸化脱耦联，ATP合成减少，导致了能量代谢、合成功能障碍。而脑是重要的耗能器官，为维持脑细胞功能活动，线粒体必将在一定时期依靠数量上的代偿性增多，提高能量供给。但这种代偿性增多是短暂的，效果也是微不足道的，不能改变神经元因能量缺乏而死亡、崩解的结局(线粒体数量减少)。因此本组实验结果线粒体数量明显增多，属于线粒体假性增生。

文献证实，急性细胞损伤时，线粒体嵴被破坏，多表现为嵴断裂、排列紊乱;慢性亚致死性细胞损伤或营养缺乏时，由于线粒体的蛋白合成受阻，不能再形成新的嵴，而呈现嵴结构不清甚至消失［5］。我们也观察到本组两种线粒体形态的变化:一种为线粒体肿胀变圆，出现空泡化，线粒体基质电子密度明显降低。我们认为这是在线粒体急性损伤、肿胀成为不可恢复之损伤后的失代偿表现。提示线粒体的功能状态下降，代表线粒体基质中与三羧酸循环、丙酮酸氧化和脂肪酸等有关的各种酶系、核糖体、DNA、RNA、基质颗粒等减少。另一种形态表现是线粒体浓缩变性，嵴萎缩、内腔皱缩、体积变小，基质蛋白质浓缩且电子密度增高，部分线粒体双层膜间填充电子致密物。我们认为这是细胞趋于坏死、线粒体崩解的结果，是不可复性损伤的表现。

本组电镜还观察到，吗啡损害早期，线粒体可单纯的表现为数量增多或者合并线粒体嵴排列紊乱或嵴逐渐崩解并形成空泡。吗啡中期损害可以出现两个相邻的异常线粒体相互融合，形成多囊状结构，进一步溶解，中央空化。而线粒体的双层膜消失代之以单层膜性结构，基质内包涵体形成，线粒体崩解、数量减少则是吗啡损害晚期线粒体的终末改变。综合分析，说明多种形式的线粒体变化、损害表现，代表不同时期的线粒体损伤，并且可以共存。

研究表明，吗啡还能诱导细胞线粒体呼吸链的Ndufab1、Ndnfb2、Ndufa12等基因下调，干扰能量物质ATP的产生［6］。线粒体功能障碍又可进一步导致自由基产生增多，过多的氧自由基可引起生物膜结构蛋白质和脂质过氧化，从而造成线粒体膜损伤，线粒体形态和结构发生病理改变。本组超微结构观察发现线粒体以内膜的破坏为主，而外膜相对完整。我们认为这是由线粒体内膜功能复杂、多样和吗啡的广泛细胞毒性决定的。首先，线粒体内膜和嵴膜的结构与线粒体的功能密切相关。线粒体内膜是进行电子传递和氧化磷酸化的部位，细胞可通过增加线粒体内膜和嵴膜的表面积来提高ATP的产量，生产较多的ATP可以提高细胞对代谢损伤和凋亡过程的保护作用;其次，线粒体内膜上还有许多特异性离子通道和非选择性的孔结构，如线粒体ATP敏感的钾通道、Ca2+单向转运体、线粒体Ca2+敏感钾通道等;再者，腺苷酸转位酶也位于线粒体内膜上，将线粒体内合成的ATP转运到胞浆内，把胞浆内的ADP转入线粒体内进行氧化磷酸化，维持线粒体和胞浆能量平衡。由此可见线粒体内膜结构的破坏，将影响线粒体的正常功能，最终造成整个细胞能量的产生障碍。最终，脑细胞供能减少，脑神经细胞Na+-K+泵活动减弱，维持神经传递的生物电不能良好的建立，致使神经递质的合成、释放以及信息的传递延迟，脑的功能活性进一步抑制。这或许就是吗啡致脑中枢各项功能障碍的始动因素。

另外，线粒体内晶格状包涵体(mitochondrial inclusionbodies，MIBs)的主要成分是线粒体肌酸激酶(mitochondrial creatine kinase，M-iCK)。线粒体基质内晶格状包涵体的形成，就是由于线粒体ATP生成障碍，M-iCK出现功能代偿而过度表达，导致酶活性较低的M-iCK堆积的结果。MIBs代表着M-iCK失活的终末阶段［7］。包涵物的形成，是由于反应代谢障碍，正常呼吸链受到抑制，氧化磷酸化过程受到破坏引起的，线粒体内结晶状包涵体的形成，说明细胞的能量基本代谢单位受到损害。是吗啡造成线粒体不可逆性损害的标志。

总之，吗啡能够造成神经元线粒体超微结构损害，引起呼吸功能和能量代谢功能障碍。线粒体损伤可作为吗啡致脑细胞毒性和脑功能受损的始发机制。

参考文献

1Maldonado R，Negus S，Koob GF.Precipitation of morphine withdrawal syndrome in rats by administration of mudelta and kappa-selective opioid antagonists.Neuropharmacology，1992，31: 1231-1241.

2郭韬，杜亚丽，张素芳，等.吗啡急性成瘾暴露猫模型的建立.脑与神经疾病杂志，2008，16: 711-712.

3Sangar MC，Bansal S，Avadhani NC.Bimodal targeting of microsomal cytochrome P450s to mitochondria: implications in drug metabolism and toxicity.Expert Opin Drug Metab Toxicol，2010，6: 1231-1251.

4郭韬，康进生，郑杰，等.吗啡急性成瘾暴露猫脑电图及神经病理特点.中华神经医学杂志，2011，10: 137-141.

5朱筑霞，吴泽江，王旭东，等.胚胎期和生长期子代大鼠砷暴露对脑细胞线粒体功能和超微结构的影响.环境与健康杂志，2011，8: 488-490.

6Nadanaciva S，Will Y.New insights in drug-induced mitochondrial toxicity.Curr Pharm Des，2011，17: 2100-2112.

7Bansal S，Srinivasana S，Anandasadagopans，et al.Additive effects of mitochondrion-targetedcytochrome CYP2E1 and alcohol toxicity on cytochromec oxidase function and stability of respirosome complexes.J Biol Chem，2012，287: 1584-1597.

(收稿日期:2014－11－20)

通讯作者:郭韬，050051石家庄市，河北省人民医院功能神经外科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.10.028

【文章编号】1002－7386(2015) 10－1526－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R 996.5