超高效液相色谱法测定水果中咪鲜胺残留量

贾巧莉，王明强*

（1.云南省曲靖市质量技术监督综合检测中心，云南 曲靖 655000；2.云南省肉制品质量监督检验中心，云南 曲靖 655000）

咪鲜胺（prochloraz）是一种广谱杀菌剂，其作用机理是通过抑制甾醇的生物合成，从而使菌体细胞膜功能受破坏而起作用，咪鲜胺广泛用于果树、蔬菜、谷物病害防止及水果的储藏保鲜和多类病害的防治，能广泛治疗多种瓜果蔬菜的炭疽病、叶斑病[1-3]等病害，对香蕉、苹果和柑橘尤其有效。在国内外都会大量使用，咪鲜胺最大残留限量一直被美国和欧盟严格监测，在水果中的最大残留限量（maximum residue limit，MRL）一直在很低的水平上[4]。咪鲜胺属低毒杀菌剂，其代谢产物具有环境毒理作用。因此，建立咪鲜胺在水果等样品中的检测方法很有必要。

目前，对于咪鲜胺残留量测定的方法主要有气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[5-6]联用、高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[7-8]联用，虽然前处理简单，但仪器昂贵难以普及应用；采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9]和气相色谱法（gas chromatography，GC）[10-11]，但前处理复杂且灵敏度相对超高效液相色谱法（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）[13-14]低。

本研究采用超高效液相色谱法测定水果中咪鲜胺的残留量，克服了仪器昂贵难以普及应用和前处理复杂且灵敏度低的缺点，该方法具有前处理简便、灵敏度高、方法可靠的特点，并有效提高检测效率，从而建立一套快速、便捷及成本低的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香蕉、苹果和柑橘：均采自于曲靖市西苑小区农贸市场。

咪鲜胺标准品：农业部环境保护科研研制所（中国天津）；甲醇、乙腈和丙酮（均为色谱纯）：美国Fisher Scientific公司；氯化钠、氨水和甲酸（均为分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；超纯水：实验室自制。

1.2 仪器与设备

UltiMate3000超高效液相色谱仪、VWD-3400紫外检测器、TTC-3000柱温箱、WPS-3000自动进样器、安CHROMLETEON 6变色龙色谱工作站：美国戴安公司；Milli-Q Advantage A10超级纯水机：美国Millipore公司；CT15RT多用途高速冷冻离心机：美国Thermo公司；Vortex-3漩涡混匀器：德国IKA公司；PHS-3C 酸度计：上海精密科学仪器有限公司；AE200分析天平：瑞士梅特勒公司；T-50微孔溶剂过滤器、微孔过滤膜（直径50 mm，孔径0.45 μm）：天津津腾过滤器件厂；Bond Elut Plexa PCX固相萃取柱：美国安捷伦公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

将样品匀浆后准确称取10.0 g于50 mL离心管中，加入10.0 mL乙腈，涡旋混匀50 s，加入2.0 g氯化钠，振荡混匀8 min，4 000 r/min离心6 min，静置2 min分层、澄清。准确吸取上清液5.0 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，加入2.0 mL超纯水和0.2 mL甲酸，混匀，准备净化。将待净化液转移至经过3.0 mL乙腈和3.0 mL水活化后的PCX固相萃取柱中。依次用2.0 mL丙酮、2.0 mL乙腈-氨水溶液（分别取30.0 mL乙腈和5.0 mL氨水于100 mL容量瓶中，加水）洗涤，抽至近干后用3.0 mL乙腈-氨水溶液洗脱并收集洗脱液。洗脱液于50 ℃条件下氮气吹干，残留物用甲醇溶解定容，混合均匀后过滤膜，供UPLC测定。

1.3.2 咪鲜胺标准溶液的配制

咪鲜胺标准溶液的配制：将1 mL咪鲜胺标准品（100 μg/mL，1 mL/支）全部移入10 mL容量瓶，用甲醇稀释定容至刻度配制成质量浓度为10 μg/mL的咪鲜胺标准储备液，再用甲醇逐步稀释，配制成质量浓度分别为0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、3.0 μg/mL、5.0 μg/mL的标准工作溶液系列。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Thermo C18色谱柱（2.2 μm，2.1 mm×50 mm）；流动相为甲醇∶水=70∶30（V/V）（经超声脱气和膜过滤）；检测波长225 nm。流速1.0 mL/min。柱温30℃。进样量10 μL。

1.3.4 咪鲜胺残留量计算公式

咪鲜胺残留量计算公式如下：

式中：X为样品中咪鲜胺残留量，mg/kg；C为所测试样样品质量浓度，μg/mL；V为样品定容体积，mL；m为样品质量（果样以鲜质量计），g。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

本研究分别考虑了甲醇-水、乙腈-水、乙酸-甲醇流动相对色谱分离效果和咪鲜胺保留时间的影响，结果表明甲醇-水分离效果最好并且保留时间短，为了进一步得到较好的峰形，又达到快捷简便的要求，经过多次甲醇-水体积配比试验，确定甲醇-水体积比为70∶30，流速为1.0 mL/min时，峰面积值最大且样品分离效果好，咪鲜胺的峰形也好，所以选用甲醇-水（70∶30，V/V）作为流动相，咪鲜胺的保留时间为5.550 min。

2.2 检测波长的选择

将标准溶液在波长180～400 nm之间进行紫外光谱扫描，发现在波长210 nm、225 nm、230 nm处有强吸收。选用波长210 nm测定灵敏度高，但基线干扰大，而试样在波长225 nm处吸收较在波长230 nm处稍强，综合考虑到咪鲜胺本身的性质以及溶剂、基质干扰、灵敏度等因素，最后确定最佳检测波长为225 nm。

2.3 标准品及样品的超高效液相色谱检测

标液及样品经0.45 μm滤膜过滤后，按照色谱工作条件的要求进行测定咪鲜胺标准品与样品，所得到的色谱图见图1。

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图1 咪鲜胺标准品(A)及样品(B) UPLC色谱图Fig.1 UPLC chromatogram of prochloraz standard(A)and sample(B)

由图1可知，在波长225 nm，甲醇-水体积比为70∶30，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL时，咪鲜胺具有典型的峰型，咪鲜胺标准品的保留时间为5.547 min；样品中咪鲜胺在此条件下分离效果好且峰面积值最大，保留时间为5.553 min。

2.4 灵敏度和线性范围

取系列质量浓度为1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL、5.0 μg/mL的咪鲜胺标准工作溶液，经0.45 μm滤膜过滤后，按上述色谱条件进样10 μL，以咪鲜胺标准进样质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图2。

图2 咪鲜胺标准曲线Fig.2 Standard curve of prochloraz

由图2可知，标准曲线线性回归方程：Y=0.107 6X+0.021 2，相关系数R=0.999 7，以3倍信噪比时的进样量计算最低检出限（limit of detection，LOD）0.032 mg/kg，结果表明咪鲜胺在0～5.0 μg/mL的质量浓度范围内峰面积与咪鲜胺的质量浓度线性关系良好。

2.5 加标回收率实验

表1 加标回收率实验结果Table 1 Results of adding standard recovery rate tests

选取香蕉、苹果和柑橘3种经常使用咪鲜胺的水果，分别准确称取10.0 g进行0.2 mg/kg、0.4 mg/kg、1.0 mg/kg 3个质量浓度添加水平进行加标回收率试验，每个水平设3个平行样。结果如表1所示。由表1可知，3种水果样品添加不同质量浓度咪鲜胺标品，回收率范围在93.00%～101.10%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.3%～3.2%，均＜5%，其结果表明该方法的准确度较高，可满足水果中咪鲜胺残留量测定的要求[15]。

2.6 精密度实验

按试验条件取10.0 μg/mL的咪鲜胺标准品重复进样10次，检测咪鲜胺含量量分别为10.287 μg/mL、10.175 μg/mL、10.168 μg/mL、10.236 μg/mL、10.363 μg/mL、10.275 μg/mL、10.236 μg/mL、9.920 μg/mL、9.957 μg/mL、9.981 μg/mL，平均值为10.159 μg/mL，测定结果RSD为0.219%＜5%，其结果表明该方法的精密度良好，可满足定量分析的要求[15]。

2.7 水果样品中咪鲜胺残留量的检测

表2 市售水果样品中咪鲜胺的残留量检测结果Table 2 Determination results of prochloraz residual amount in market fruit samples

3 结论

本研究建立了超高效液相色谱法对3种水果样品中咪鲜胺残留量的检测，以甲醇∶水=70∶30（V/V）为流动相，流速1.0 mL/min条件下等度洗脱，检测波长225 nm，快速测定水果中咪鲜胺残留量。结果表明，咪鲜胺标准线性回归方程为Y=0.107 6X+0.021 2，相关系数R=0.999 7，检出限为0.032 mg/kg，加标回收率为93.00%～101.10%，精密度实验结果相对标准偏差为0.219%，说明该方法准确度、重复性、精密度良好、操作简便，可用于水果中咪鲜胺残留量测定，是一种较为理想的分析方法。

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