KLF4在糖尿病小鼠心肌组织的表达及通心络胶囊干预作用研究

张哲，王超

(河北省人民医院省老年医学重点实验室，河北石家庄　050051)



KLF4在糖尿病小鼠心肌组织的表达及通心络胶囊干预作用研究

张哲，王超

(河北省人民医院省老年医学重点实验室，河北石家庄050051)

摘要:目的探讨糖尿病小鼠心肌组织Krüppel样因子4 (KLF4)表达及通心络(TXL)对其干预作用。方法KK/Upj-Ay小鼠40只，随机分为糖尿病模型组、TXL低、中、高剂组，每组10只，另设C57BL/6(C57)小鼠10只作为对照组。按照分组给予不同剂量处理因素，疗程3个月，测定各组空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)，空腹胰岛素(FINS)、计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR) ;放射免疫法测定各组血清TNF-α、IL-6水平; HE染色观察心肌组织病理变化; Real time-PCR和Western blot测定心肌组织KLF4 mRNA和蛋白表达; Western blot测定心肌组织核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)核蛋白表达。结果与对照组比较，模型组FBG、HbA1c、TG、TC、FINS、HOMA-IR及TNF-α、IL-6水平明显增高，KLF4 mRNA和蛋白表达明显降低，NF-κB核蛋白表达明显升高(P＜0.01)，通心络胶囊能够明显减轻心肌组织病理损伤，降低FINS、TG、TC、HOMA-IR、TNF-α、IL-6水平及NF-κB核蛋白表达，同时上调KLF4表达(P＜0.05)，但不影响FBG、HbA1c(P＞0.05)。结论KLF4可能参与了糖尿病心肌病的发生发展。通心络胶囊可减轻糖尿病心肌病理损伤及改善心功能，其机制可能与上调KLF4表达及抑制NF-κB炎症信号通路的激活有关。

关键词:通心络胶囊;糖尿病心肌病; Krüppel样因子4;血糖;血脂; NF-κB;炎症;信号通路

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病晚期并发症之一，主要临床表现为心脏收缩和舒张功能障碍、心律失常甚至心力衰竭［1］。目前，有关DCM的发病机制尚未完全明确。研究显示，糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、微血管病变、细胞凋亡等多种病理变化参与了DCM的发生发展，其中胰岛素抵抗贯穿于糖尿病的始末，是DCM发病的关键环节［2］。Krüppel样因子4 (Krüppel-like factor 4，KLF4)是一种锌指蛋白转录因子，参与调控细胞增殖、分化、炎症和肿瘤形成等生理和病理过程。我们前期研究表明KLF4过表达具有明显的改善骨骼肌胰岛素抵抗的作用，提示KLF4在胰岛素抵抗形成中发挥重要作用［3］。Yoshida等［4］最近研究发现，KLF4在心肌肥厚、动脉粥样硬化、血管损伤等心血管疾病中发挥重要调控作用，结合我们的研究结果提示了KLF4可能在DCM发病机制中发挥重要作用。然而，有关KLF4在DCM发病机制中的作用目前尚未见报道。本研究以自发性糖尿病模型KK/Upj-Ay小鼠为研究对象，观察KLF4在DCM心肌组织的表达情况，探讨通心络胶囊对DCM的保护作用及可能机制，为DCM的中医药治疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器兔抗KLF4、NF-κB p65﹑GAPDH多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。TNF-α、IL-6放免试剂盒购自美国R＆D公司。EasyScript First-strand cDNA synthesis SuperMix试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。TRIzol、实时荧光定量试剂盒购自美国Promega公司。通心络胶囊(批号: 060739，卫药准字:97-Z-001号)由石家庄以岭药业股份有限公司提供。

7080全自动生化分析仪(日本日立公司)，Mastercycler gradient PCR仪(德国Eppendorf公司)，ABI PRISM 7300 PCR System(美国Applied Biosystems)，凝胶成像系统(美国UVP公司)。

1.2方法

1.2.1实验动物、分组及给药选取12周龄SPF 级KK/Upj-Ay和C57BL/6小鼠，♂，体质量分别为30～40 g和25～30 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，(20～25)℃常规饲养。按空腹血糖值(FBG)将40只KK/Upj-Ay小鼠分为4组:糖尿病模型组、TXL低剂量(1 g生药·kg－1)、中剂量(2 g生药·kg－1)、高剂量(4 g生药·kg－1)组，另设C57BL/6小鼠10只为对照组，对照组和模型组给予等体积蒸馏水，每天1次灌胃给药，疗程3个月。每周测量并记录各组FBG、HbA1c、TG及TC。

1.2.2心功能检测给药12周后，小鼠禁食12 h，称重，按照30 mg·kg－1剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰卧位固定。分离右颈总动脉，将心室插管经右颈总动脉插至左心室，连接生物信号记录仪测定左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒张末期压力(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)和左心室最大收缩/舒张速率(the maximum rate of myocardial contraction and the maximum rate of myocardial diastole，±dp/dtmax)。

1.2.3HE染色取小鼠冠状切面心肌组织，置于甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE染色。高倍镜下观察心肌细胞形态结构。用Image-Pro Plus 6.0图像处理系统分别测定左心室前壁厚度(left ventricular wall thickness，LVWT)和室间隔厚度(interventricular septal thickness，IST)。每组3～4只动物，每只动物观察2张切片，取平均值。

1.2.4放射免疫法12周末实验结束后行断尾取血法，将3 ml血3 500 r·min－1离心10 min，取上清，－80℃保存。采用放射免疫法测定外周血TNF-α、IL-6水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.5Real-time PCR根据GenBank中小鼠KLF4 mRNA序列，采用DNAMAN软件设计引物，引物序列见Tab 1，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。TRIzol提取心肌组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，反转录合成cDNA第1链。PCR扩增完毕，进入ABI 7300型荧光定量PCR仪附带的SDS v1.3软件结果分析界面，设基线为3～15个循环，得到各样本、各基因扩增的Ct值。设对照组样品为标准1，目的基因表达水平的相对定量值RQ=2－△△Ct，将RQ值用于统计分析，设GAPDH为内参照基因。

Tab 1 Primers sequence for Real-time PCR and product length

1.2.6Western blot取心肌组织，常规方法提取总蛋白，测定KLF4蛋白水平，采用Deryckere and Gannon法提取核蛋白测定NF-κB p65蛋白水平，BCA法进行蛋白定量，按4∶1体积比加入5×上样缓冲液内混匀，100℃煮沸5 min变性，置于－20℃冰箱备用。将100 μg总蛋白进行10% SDS-PAGE，电转移至PVDF膜上，10%脱脂奶粉封闭2 h。用特异性抗NF-κB p65抗体(1∶2 000稀释) 4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀释)室温孵育1 h，洗膜后ECL化学发光法显色、定影。用UVP软件检测并分析蛋白条带IOD值，GAPDH作为内参照，以目的蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行定量分析。

1.3统计学处理采用SPSS 10.0软件包处理数据，结果以±s表示。两个样本均数比较采用Dunnett t检验。

2　结果

2.1通心络胶囊对DCM小鼠糖脂代谢指标的影响与对照组比较，模型组小鼠出现明显的高血糖和高血脂，FBG、HbA1c、TG、TC、FINS、HOMA-IR均明显增高(P＜0.01) ;给药12周后，与模型组比较，TXL中、高剂组TG、TC、FINS水平及HOMA-IR不同程度降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，同时FBG、HbA1c亦有下降趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)，提示通心络胶囊具有明显的降脂作用，但无降糖作用。见Tab 2。

Tab 2 Effects of TXL on levels of blood sugar and blood lipids in DCM mice(珋±s，n=10)

Tab 2 Effects of TXL on levels of blood sugar and blood lipids in DCM mice(珋±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group

Group　FBG/mmol·L－1　HbA1c/%　TG/mmol·L－1　TC/mmol·L－1　FINS/pmol·L－1HOMA-IR Control　5.56±0.89　5.06±0.48　0.88±0.31　1.75±0.54　34.13±4.58　2.49±0.42 Model　18.97±3.18＊＊　12.31±3.26＊＊　1.52±0.68＊＊　5.79±2.53＊＊　98.28±13.46＊＊　22.76±3.75＊＊TXL low dose　16.75±2.77　10.72±2.56　1.48±0.75　5.36±2.84　89.22±16.45　20.46±5.13 TXL middle dose 15.56±2.34　10.24±2.32　1.27±0.75#　3.13±1.47#　63.65±9.34#　9.20±3.28#TXL high dose　15.12±2.86　9.79±1.84　1.02±0.44#　1.84±0.68#　41.21±6.15#　3.78±0.52#

2.2通心络胶囊对DCM小鼠心功能的影响心功能指标中LVSP、+ dp/dtmax反映心脏的收缩功能，LVEDP、－dp/dtmax反映心脏的舒张功能。结果显示，与对照组比较，模型组LVSP、+ dp/dtmax、－dp/dtmax明显降低，LVEDP明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01) ;给药12周后，与模型组比较，TXL中、高剂组LVSP、+ dp/dtmax、－dp/dtmax明显升高，LVEDP明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示通心络胶囊能够明显改善DCM小鼠心脏收缩和舒张功能。见Tab 3。

Tab 3 Effects of TXL on cardiac function in DCM mice(珋±s，n=10)

Tab 3 Effects of TXL on cardiac function in DCM mice(珋±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group

+dp/dtmax/－dp/dtmax/Group　LVSP/kPa　LVEDP/kPa kPa·s－1kPa·s－1Control　15.77±1.66　0.07±0.03　844±70　778±67 Model　5.83±0.68＊＊0.64±0.16＊＊　309±30＊＊　270±29＊＊TXL low dose　6.84±0.77　0.57±0.19　334±32　301±32 TXL middle dose　11.77±1.10#　0.19±0.08#　685±58#　629±56#TXL high dose　12.71±1.24#　0.11±0.06#　761±62#　669±59#

2.3通心络胶囊对DCM小鼠体质量、心室壁厚度的影响与对照组比较，模型组小鼠出现明显的多饮、多食、多尿症状，同时体质量明显降低，室间隔厚度(IST)和左心室前壁厚度(LVWT)明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01) ;给药12周后，与模型组比较，TXL中、高剂组IST、LVWT明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，而体质量差异无统计学意义(P＞0.05)，提示通心络胶囊能够明显抑制DCM小鼠心肌肥厚和心室重构。见Tab 4。

Tab 4 Effects of TXL on body weight and heart wall thickness in DCM mice±s，n=10)

Tab 4 Effects of TXL on body weight and heart wall thickness in DCM mice±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group

Group　Body weight/g　IST/mm　LVWT/mm Control　40.48±2.75　0.78±0.08　1.98±0.31 Model　30.23±2.17＊＊　1.54±0.13＊＊　2.68±1.05＊＊TXL low dose　30.44±3.42　1.49±0.18　2.59±1.26 TXL middle dose　32.08±2.23　1.26±0.12#　2.31±1.35#TXL high dose　33.41±2.67　1.02±0.11#　2.12±0.89#

2.4通心络胶囊对DCM小鼠血清TNF-α、IL-6水平的影响为观察通心络胶囊对DCM小鼠血清TNF-α、IL-6水平的影响，我们采用放射免疫法检测血清TNF-α、IL-6水平。结果显示，与对照组比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-6水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01) ;给药12周后，与模型组比较，TXL中、高剂组TNF-α、IL-6水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示通心络胶囊能够明显抑制DCM小鼠心肌炎症反应，减少炎症介质在心肌的积聚。见Tab 5。

Tab 5 Effects of TXL on serum TNF-α and IL-6 levelsin DCM mice(珋±s，n=10)

Tab 5 Effects of TXL on serum TNF-α and IL-6 levelsin DCM mice(珋±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group

Group　TNF-α/mol·L－1　IL-6/mol·L－1Control　0.82±0.13　1.05±0.07 Model　2.77±0.30＊＊　3.22±0.43＊＊TXL low dose　2.53±0.36　3.16±0.49 TXL middle dose　1.62±0.18#　2.23±0.26#TXL high dose　0.98±0.15#　1.41±0.11#

2.5通心络胶囊对DCM小鼠心肌组织病理形态的影响HE染色结果显示:对照组小鼠心肌HE染色可观察到心肌细胞排列整齐，边界清晰，无肿胀坏死;模型组心肌细胞排列紊乱，边界不清，线粒体肿胀，细胞核固缩、裂解甚至丢失，肌原纤维断裂、分离，间质炎性细胞浸润及出现多发坏死灶;给药12周后，与模型组比较，TXL中、高剂组心肌形态结构有不同程度改善，坏死灶面积明显减小，提示通心络胶囊能够明显减轻DCM小鼠心肌形态学损伤。见Fig 1。

Fig 1 Comparison of HE staining of myocardium in different groups(HE×400)

2.6通心络胶囊对DCM小鼠心肌组织KLF4表达的影响Real time-PCR和Western blot结果显示:与对照组比较，模型组KLF4 mRNA和蛋白表达分别降低了64.5%和73.2%，差异有统计学意义(P＜0.01) ;给药12周后，与模型组比较，TXL中、高剂组KLF4 mRNA和蛋白表达均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示通心络胶囊可能通过上调DCM小鼠心肌KLF4表达发挥心肌保护作用。见Fig 2。

Fig 2 Effects of TXL on the expression of KLF4 mRNA(A) and protein(B) in cardiac tissue(±s，n=10)

1: Control; 2: Model; 3: TXL low dose; 4: TXL middle dose; 5: TXL high dose，＊＊P＜0.01 vs control group;▲P＜0.05 vs model group.

2.7通心络胶囊对DCM小鼠心肌组织NF－κB核蛋白水平的影响为观察通心络胶囊对DMC小鼠心肌细胞核NF-κB p65表达的影响，我们采用Western blot技术检测NF-κB p65核蛋白水平。结果显示，与对照组比较，模型组NF-κB p65核蛋白表达升高了238.1%，差异有统计学意义(P＜0.01) ;给药12周后，与模型组比较，TXL中、高剂组NF-κB p65核蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示DCM小鼠心肌存在NF-κB信号通路的过度激活，通心络胶囊的心肌保护作用依赖于NF-κB信号通路的抑制。见Fig 3。

Fig 3 Effects of TXL on the expression of NF-κB p65 protein in cardiac tissue(±s，n=10)

3　讨论

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病患者由于长期高血糖引起的心肌和微血管病变，是糖尿病的独立并发症之一。DCM发病机制复杂，糖脂代谢紊乱、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、微血管病变、细胞凋亡等均是DCM发生发展的重要促进因素，其中胰岛素抵抗贯穿于糖尿病的始末，是DCM发病的的重要环节，最终导致心肌肥厚、间质纤维化、心脏收缩和(或)舒张功能不全甚至心力衰竭［2］。研究表明胰岛素抵抗对心脏功能的损害主要与胰岛素抵抗状态下糖脂代谢紊乱、胰岛素信号传导通路异常、内皮功能障碍及炎症反应有关，其中炎症反应是胰岛素抵抗发生的关键因素。炎症因子诱导胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)特定位点的丝/苏氨酸残基磷酸化，抑制胰岛素受体(IR)与IRS-1的相互作用，阻止IRS-1对其下游磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3-K)磷酸化的激活过程，减弱靶细胞葡萄糖转运蛋白4 (glucose transporter 4，GLUT-4)的表达及对葡萄糖的摄取和糖原合成，最终导致胰岛素抵抗发生，这是炎症因子介导胰岛素抵抗形成的主要分子机制［5］。此外，在临床治疗中我们发现即使严格控制血糖、血脂水平也不能完全阻断部分糖尿病患者心肌病变的进展，我们推测DCM心肌损伤并不是糖脂代谢紊乱和心脏功能失调的直接后果，免疫炎症反应在其中发挥至关重要的作用。NF-κB是细胞中的一个重要的转录因子，在炎症反应的调节中起主导作用。基础和临床实验均证实，糖尿病心肌中白细胞和炎症因子异常高表达，且NF-κB在炎症反应中起重要调控作用，其中p65是NF-κB行使功能的必需亚单位［6－7］。炎症反应中伴有TNF-α、IL-6、CRP等细胞因子水平的异常升高，促进血管斑块形成和微血管病变。此外，TNF-α还可减少心肌细胞对葡萄糖的利用，增强对脂肪酸和酮体的利用，造成心肌能量代谢紊乱［8］。

KLF4是广泛表达在血管内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、淋巴细胞等靶点细胞的转录因子，定位于细胞核，通过调控多个基因的转录激活或抑制参与细胞增殖、分化、炎症反应及肿瘤形成等生理和病理过程［9］。Shen等［10］研究发现KLF4过表达能够促进血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)的生成，具有明显的抗炎和抗血栓作用。2014年，Yoshida等［4］研究发现KLF4过表达通过调控myocardin的表达和活性抑制异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚，说明KLF4在心血管疾病的发生发展中发挥重要调控作用。Yoshida等［11］研究发现KLF4是促炎因子激活NF-κB过程中的一个重要调控因子，特异性敲除内皮细胞KLF4基因导致NF-κB激活和核转位，进而促进TNF-α、IL-6等多种炎症因子的表达和释放，最终导致血管平滑肌细胞的增殖和炎症细胞浸润(巨噬细胞和T淋巴细胞)。继而作者采用免疫共沉淀技术在人脐静脉内皮细胞中直接观察到KLF4 与NF-κB p65蛋白的相互结合，且导入KLF4基因通过抑制炎症刺激诱发的NF-κB的激活发挥明显的抗炎和抗增殖作用。因此，我们推测在心肌细胞KLF4同样调控NF-κB的活化，采用药物或siRNA阻断这一重要环节就可以减轻TNF-α、IL-6等炎症因子对心肌的损伤，这对于防治糖尿病及阻止DCM病理进程具有重要意义，但具体机制有待相关研究进一步证实。本研究在自发性糖尿病小鼠模型基础上，研究发现模型组小鼠出现明显的糖脂代谢紊乱、血清TNF-α、IL-6水平、心肌组织NF-κB表达及HOMA-IR均较对照组明显升高，KLF4 mRNA和蛋白表达明显降低(P＜0.05)，与国内外研究结果一致［11-12］，提示KLF4介导的NF-κB炎症信号通路的激活在胰岛素抵抗及DCM发生发展中发挥重要作用。

通心络胶囊是包含人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鳖虫，蝉蜕、赤芍等成分的中药复方制剂，具有抑制血小板聚集、抗血栓形成及改善血管内皮功能等多种药理作用，广泛应用于冠心病的治疗［13 -14］。本研究结果显示，通心络胶囊可通过降低血清TG、TC含量，调节DCM小鼠脂质代谢，减轻心肌组织病理损伤及炎症反应，与模型组比较，通心络中、高剂组TNF-α、IL-6含量及NF-κB表达明显降低，KLF4表达明显升高，且呈剂量依赖性。本研究结果提示，通心络胶囊可能是通过上调心肌组织KLF4表达、抑制NF-κB表达和炎症因子的分泌和释放改善脂质代谢紊乱及胰岛素抵抗，从而发挥心脏保护作用。KLF4可能是通心络胶囊发挥药理作用的重要靶点之一，对KLF4在糖尿病心肌病发病中的作用进行深入研究，有望为糖尿病心肌病的预防、早期治疗及延缓疾病进展提供新的理论依据。

(本实验在河北省人民医院省老年医学重点实验室完成。)

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◇研究简报◇

Expression of KLF4 in diabetic mouse myocardium and the interventional effect of Tongxinluo capsule on diabetic cardiomyopathy

ZHANG Zhe，WANG Chao
(People’s Hospital of Hebei Province，Key Laboratory of Geriatric Medicine，Shijiazhuang 050051，China)

Abstract:AimTo observe the expressions of KLF4 in the myocardium of diabetic mice and their changes under Tongxinluo capsule intervention.Methods Forty KK/Upj-Ay mice were randomly divided into diabetic model group(n=10) and diabetic model with Tongxinluo(TXL low，middle，high) groups(n=10，respectively).C57BL/6 mice were selected as control group (n=10).At the end of the 3th month the mice were sacrificed and were weighed.The fasting blood-glucose (FBG)，glycosylated hemoglobin(HbA1c)，triglyceride (TG)，total cholesterol (TC) and insulin(FINS) were measured to calculate HOMA-IR.Radioimmunoassay was used to measure serum TNF-α and IL-6.The pathological changes in the myocardium of mice were observed by HE staining.KLF4 mRNA was examined by Real-time PCR，while KLF4 and NF-κB protein were measured by Western blot.Results Compared to the control group，FBG，HbA1c，TG，TC，FINS，HOMA-IR，TNF-α and IL-6 in model group were markedly increased; the expressions of myocardial KLF4 were markedly decreased and the expression of nuclear NF-κB protein were markedly increased (P＜0.01).Tongxinluo capsule could significantly reduce myocardial pathological damage，FINS，TG，TC，TNF-α，IL-6 level and the expression of nuclear NF-κB protein and up-regulate the expression of KLF4 (P＜0.05)，but had no effect on FBG and HbA1c(P＞0.05).Conclusions KLF4 may be involved in the development of myocardial injury during diabetes.Tongxinluo capsule can ameliorate the myocardial damage and improve the function of diabetic myocardium by up-regulating the expression of KLF4 and inhibiting the activation of NF-κB inflammatory signal pathway.

Key words:Tongxinluo capsule; diabetic cardiomyopathy; Krüppel-like factor 4; blood sugar; blood lipids; NF-κB; inflammation; signal pathway

作者简介:张哲(1980－)，女，博士，助理研究员，研究方向:代谢综合征、糖尿病、血脂紊乱和骨质疏松等疾病发病机制，Tel:0311-85988007，E-mail: zhe_zhang80@126.com;王超(1975－)，男，博士，副研究员，研究方向:代谢综合征、糖尿病、血脂紊乱和骨质疏松等疾病发病机制，通讯作者，Tel:0311-85988310，E-mail:13731156811@139.com

基金项目:河北省自然科学基金资助项目(No C2011307008)

收稿日期:2015－02－22，修回日期:2015－04－05

文献标志码:A

文章编号:1001－1978(2015) 06－0876－06中国图书分类号: R-332; R287; R322.11; R394.2; R587.202.2; R587.201

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.027